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开发更有效的抗肿瘤疫苗一直是肿瘤免疫治疗的主要目标之一。本论文选择Hca-F和L929细胞系为模型，在体外比较卡介苗来源的HSP70-肽复合物(HSP70-BCG)和Hca-F榄香烯复合瘤苗来源的HSP70-肽复合物(HSP70-EC-TCV)冲激的DCs抗Hca-F和L929效应；探讨Toll-likeReceptor4(TLR4)信号通路在HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV激活DCs过程中的作用；体外构建的Hca-F榄香烯复合瘤苗抗原肽-HSP70-BCG复合物(HTA-HSP70-BCG)激活的DCs的体内外抗瘤效应，主要结果如下：
一.HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV抗原肽复合物对DCs的冲激作用
1.HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV由本室从Hca-F榄香烯复合瘤苗细胞和BCG中提取，Westernblot证实，全过程以低压液相色谱监控。
2.骨髓来源的不成熟DC通过在培养基中加入GM-CSF(20ng/ml)和IL-4(20ng/ml)培养5天获得。
3.以HSP70-BCG(25μg/ml)和HSP70-EC-TCV(25μg/ml)冲激DC24h，用ELISA法检测上清中IL-12浓度，用流式细胞仪检测DC表面CD86和CD40的表达。
4.用不同冲激的DCs刺激脾T细胞，ELISA法检测24h、48h和72h上清中IL-2浓度。以Hca-F和L929为靶细胞，通过MTT法测定刺激5天的T细胞的细胞毒活性。
二.TLR4对HSP70-BGG和HSP70-EC-TCV诱导DCs成熟的影响
1.骨髓来源的DC，在培养基中含GM-CSF20ng/ml和IL-420ng/ml条件下培养5天获得，该DCs被培养在24孔板中，分别加入HSP70-BCG25μg/ml、HSP70-EC-TCV25μg/ml、LPS1μg/ml；另取三个孔，提前半小时加入抗TLR4抗体10μg/ml封闭TLR4后，再分别加入三种刺激物(LPS为阳性对照)。24h后取上清用ELISA法检测IL-12浓度，收获细胞用流式细胞仪检测CD86和CD40的表达。
2.从脾分离的T细胞在24孔板中培养，分别加入HSP70-BCG、HSP70-EC-TCV冲激的DCs、LPS刺激的DCs，预先用Anti-TLR4抗体处理后再冲激的DC和不成熟DC(对照)，于24h收集上清用ELISA法测IL-2浓度，于5天收获T细胞用于细胞毒试验；以Hca-F为靶细胞，与不同处理的DCs培养72h，用MTT法检测细胞毒活性。
.三.体外构建的HTA-HSP70-B~对小鼠骨髓DCs的冲激作用
1.从榄香烯处理的Hca-F细胞提取肿瘤抗原肽(HTA)、HSP70-BCG和ADP按一定比例混合，使之相互作用形成复合物(HTA-HSP70-BCG)，收集培养5天的不成熟DCs，分别加入HSP70-BCG25μg/ml，HTA25μg/ml和HTA-HSP70-BCG25μg/ml，在6孔板中培养24h，收集细胞做细胞表型分析。
2.将全脾细胞与不同处理的DCs共同培养72h，用MTT法测定增殖活性显不，HSP70-BCG和HTA-HSP70-BCG冲激的DCs组增殖指数大于HTA组，将全脾细胞与不同处理的DC共同培养5天，分别以Hca-F和L929为靶细胞，3天后用MTT法测细胞毒活性。
四.HTA-HSP70-BCG诱导的DCs的体内抗瘤作用
1.取健康BALB/C(SPF)小鼠40只，第0天右腋皮下接种Hca-F细胞2×105/只，第五天随机分成5组，每组8只，雌雄各半，分别为：(1)攻击对照组，不进行任何治疗；(2)环磷酰胺化疗组，第五天在接种部位注射环磷酰胺(CTX)100mg/kg体重(2.5mg/只)；(3)环磷酰胺+不成熟DC组，注射CTX6小时后，于小鼠左腋皮下注射不成熟DCs与脾细胞混合物3×106/只；(4)环磷酰胺+HTA-HSP70-BCG组，注射CTX6小时后，于小鼠左腋皮下注射HTA-HSP70-BCG复合物50μg/只；(5)环磷酰胺+HTA-HSP70-BCGDCs组，注射CTX6小时后，于小鼠左腋皮下注射HTA-HSP70-BCG冲激的DCs与脾细胞混合物3×106/只。于第26天解剖小鼠，称瘤重。
2.制备各组小鼠全脾细胞作为效应细胞，以Hca-F瘤细胞为靶细胞，培养72小时，只有HTA-HSP70-BCG冲激的DCs组脾细胞对Hca-F有细胞毒作用(与对照和CTX相比，P＜0.05)。
本研究证实HSP70-BCG、HSP70-EC-TCV和HTA-HSP70-BCG在体外均可诱导DCs成熟；TLR4信号传导通路参与HSP70-BCG和HSP70-EC-TCV诱导的DCs成熟，对DCs分泌IL-12是必要的；体外构建的HTA-HSP70-BCG冲激的DC瘤苗可有效激活荷瘤小鼠的淋巴细胞产生特异性抗瘤效应，而HTA-HSP70-BCG、不成熟DCs在已荷瘤的小鼠体内不能诱导出抗瘤效应，说明荷瘤小鼠体内的肿瘤细胞抗原表达及DCs均存在缺陷，为在体外构建DC疫苗对肿瘤进行生物治疗提供实验依据。