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目的:研究小鼠心肌梗死后,微小RNA-125b(microRNA-125b,miR-125b)调控高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)释放诱导的炎症反应及其对心肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等3种参与心梗进展调节的细胞的调控作用。方法:(1)建立小鼠(C57BL/6)心梗模型,采用RT-PCR方法检测心梗早期3d或5d miR-125b及炎性细胞因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达变化;用免疫组化和免疫荧光方法检测小鼠心肌梗死后内源性HMGB1的表达。构建miR-125b过表达腺病毒及对照腺病毒载体感染心梗后心脏组织,应用心脏彩超观察心梗后miR-125b过表达对小鼠心功能的影响。(2)体外实验研究:合成重组小鼠HMGB1蛋白作为炎性介质进行体外研究。选择心梗后参与疾病病程调控的3种心脏组成细胞:心肌细胞系H9C2、成纤维细胞系10T1/2和原代巨噬细胞作为研究对象。使用mi R-125b过表达腺病毒及对照腺病毒载体体外感染H9C2和10T1/2细胞;合成mi R-125b模拟物miR-125b mimic或对照模拟物control mimic转染小鼠腹腔原代巨噬细胞;通过RT-PCR和ELISA技术分别检测3种心脏组成细胞中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA及其细胞培养上清液中的蛋白水平。用Western blot方法检测巨噬细胞的炎症反应核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-kB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路中P65、C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase,JNK)、P38以及细胞外信号调节激酶(extracellularsignal-regulatedkinase,erk)的磷酸化水平。(3)心梗后感染过表达mir-125b及对照腺病毒的心脏组织予cd11b+细胞磁珠分选出巨噬细胞,采用rt-pcr方法检测其il-1β、il-6、tnf-α的mrna表达。结果:(1)小鼠心梗炎症期心肌组织中mir-125b表达增加。小鼠心梗术后第3d,心梗组心梗边缘心肌组织mir-125b表达量(6.10±0.11)较假手术组(sham组)(1.00±0.00)显著增加(p<0.05),术后第5d,心梗组mir-125bmrna表达量(2.42±0.06)较sham组(1.00±0.00)显著增加(p<0.05)。心梗后心脏过表达mir-125b的小鼠术后2w及4w,实验组心功能检测lvef及lvfs值较对照组均显著下降,术后2w,lvef(60.33±9.07)%vs(68.67±1.52)%,lvfs(29.02±0.71)%vs(33.26±4.24)%;(p<0.05);术后4w,lvef(56.23±1.04)%vs(64.02±4.58)%,lvfs(20.50±2.12)%vs(24.63±2.83)%,(均p<0.05)。(2)同一时期检测到心肌组织和梗死边缘区内源性危险分子hmgb1表达增加以及大量炎性细胞因子产生。心梗第5d,免疫组化显示心梗组梗死边缘区心肌组织中hmgb1蛋白表达较sham组增加(p<0.05);心梗第3d,心梗组梗死边缘区心肌组织免疫荧光可见标记红色荧光的hmgb1阳性信号较sham组增加。心肌梗死第3d和第5d,心梗组梗死边缘组织il-1β、il-6、il-12、tnf-αmrna水平均较sham组显著增高(p<0.05或p<0.01)。(3)使心肌细胞、成纤维细胞和巨噬细胞体外转染过表达mir-125b,hmgb1诱导炎性因子的表达pcr检测结果:原代巨噬细胞,过表达mir-125b可促进炎性细胞因子il-1β、il-6、il-12、tnf-α的产生。刺激3h,il-1β、il-6、il-12、tnf-αmrna的表达水平比较,mirna-125b过表达实验组较对照组均不同程度地增高,il-1βmrna[(2815.44±199.02)vs(1087.5±67.18),(p<0.05)];il-6mrna[(5.55±2.12)vs(3.05±0.78),(p>0.05)];il-12mrna[(260.51±52.32)vs(147.08±26.87),(p<0.01)];tnf-αmrna[(54.00±10.68)vs(40.62±8.83),(p>0.05)];而刺激6h,实验组较对照组il-1β、il-6、il-12、tnf-αmrna相对表达亦显著增高,IL-1βmRNA[(11093.48±2637.83)vs(5313.987±1022.94),(p<0.01)];IL-6 mRNA[(20.23±3.91)vs(6.16±1.19),(p<0.01)];IL-12 mRNA[(484.56±36.14)vs(245.50±30.41),(p<0.01)];TNF-αmRNA(84.22±22.65)vs(60.30±9.28),(p<0.01)]。ELISA法检测HMGB1刺激巨噬细胞胞培养上清液炎性细胞因子水平,结果显示,刺激3h,上清中IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α水平,过表达mi R-125b实验组与对照组比较有不同程度的升高,但两组比较,差异无统计学意义。而刺激6h,,实验组上述细胞因子水平比对照组,显著升高,IL-1β[(480.32±113.14)vs(330.87±70.71),(p<0.05);IL-1β[(688.09±72.12)vs(405.71±42.43),(p<0.01)];IL-12[(32.55±4.95)vs(19.50±3.54),(p<0.05)];TNF-α[(2264.5±161.93)vs(1393.18±193.74),(p<0.05)]。在心肌细胞及成纤维细胞的刺激培养实验中,IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α的mRNA水平及细胞外上清液蛋白水平亦有不同程度变化,但差异均无统计学意义(p>0.05)。(4)小鼠心梗模型中,miR-125b过表达及对照腺病毒感染心脏组织(心梗同时)分离出的巨噬细胞其炎性细胞因子表达PCR结果显示:实验组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA水平较对照组增高(P<0.05)。(5)Western Blot结果,过表达miR-125b选择性正向调控rmHMGB1诱导原代巨噬细胞产生的炎症反应,过表达miR-125b实验组与对照组比较,仅有P65磷酸化较为明显,P38、JNK、ERK磷酸化无明显变化。结论:心肌梗死后梗死边缘区HMGB1表达增加,促炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α及mi R-125b表达上调。miR-125b正向调控心肌梗死后HMGB1诱导巨噬细胞产生的炎症反应,其机制可能通过激活NF-κB信号通路促进P65磷酸化的作用而调控炎症反应。