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中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)是石蒜科水仙属多年生草本植物,是观赏价值极高的我国传统花卉。由于中国水仙是三倍体植物,高度不育,一般只能通过小鳞茎进行无性繁殖,以传统的杂交育种方式很难培养出新的品种。中国水仙品种比较稀少,花色单一,产业发展受到了影响。通过对中国水仙的花色进行分子机制方面的研究,对中国水仙花色进行创新。本实验以中国水仙‘金盏银台’为材料,从中国水仙花瓣和副冠转录组数据库中筛选出一条与类黄酮合成相关的b HLH转录因子,命名为Ntb HLH1,利用3′RACE技术克隆出这条基因的全长序列,同时对其进行序列分析;通过q-PCR检测Ntb HLH1基因在中国水仙鳞茎盘以及花瓣和副冠在花苞期、始花期和盛花期的相对表达水平;构建植物表达载体,进行烟草稳定转化研究基因功能,并分析转基因植株中类黄酮代谢途径相关结构基因的表达以及转基因植株中总黄酮和花青素含量的变化;通过酵母双杂交实验验证了Ntb HLH1与7个R2R3-MYB转录因子互作的情况;通过双荧光素酶试验分析了Ntb HLH1与7个R2R3-MYB形成复合物对类黄酮合成途径的结构基因的调控作用。研究结果初步阐明了Ntb HLH1的功能以及MYB-b HLH复合物对类黄酮合成途径结构基因启动子的调控作用,为进一步了解中国水仙类黄酮合成途径的调控机制奠定基础。本实验主要获得了以下研究结果:1.利用3′RACE技术,从中国水仙鳞茎盘中克隆得到Ntb HLH1基因c DNA编码区全长序列,序列分析显示Ntb HLH1基因的开放阅读框大小为1896bp,编码632个氨基酸;Ntb HLH1的Gen Bank登录号为QDS02912.1;通过蛋白多重序列比对分析发现Ntb HLH1基因含有DNA结合保守结构域和HLH保守结构域,属于类黄酮合成途径的b HLH家族基因;系统进化树分析表明Ntb HLH1与类黄酮合成相关的Ⅲf亚族的Ph JAF13、At GL3和At EGL3等聚为一类;q-PCR分析Ntb HLH1在中国水仙在不同花期、不同器官的表达,Ntb HLH1在鳞茎盘的表达量最高,在花瓣和副冠中Ntb HLH1基因的相对表达量随着中国水仙花的开放先减少后升高,其中花瓣在花蕾期的表达量最高,而副冠在盛花期的表达量达到最高。2.构建p SAK277-Nb HLH1植物表达载体,导入农杆菌,稳定转化烟草获得转化植株,过表达Ntb HLH1使得转基因植株花瓣颜色变深;与野生型烟草相比,转Ntb HLH1基因烟草植株花瓣中类黄酮代谢途径的结构基因CHS和DFR以及转录因子AN1的相对表达量都有显著性的增加;通过对其总黄酮和花青素含量的测定,与野生型烟草相比,转基因植株的总黄酮和花青素的含量都有显著性提高。研究结果初步表明在烟草中Ntb HLH1可以通过调控烟草类黄酮合成途径的b HLH家族AN1分支的转录因子AN1的表达水平,从而调控烟草中花青素的合成与积累。3.分别构建Ntb HLH1与中国水仙7个R2R3-MYB蛋白的酵母双杂交表达载体,研究Ntb HLH1与7个R2R3-MYB蛋白进行相互作用,研究结果表明,Ntb HLH1与Nt MYB4、Nt MYB6、Nt MYB7和Nt MYB8能相互作用,形成MBW复合体。4.双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,Ntb HLH1单独注射能够激活中国水仙类黄酮合成途径的结构基因Nt FLS的表达,而Ntb HLH1和Nt MYB4共同转化激活效果更加显著;Nt MYB6、Nt MYB7单独情况下就可以激活中国水仙类黄酮合成途径结构基因Nt DFR的表达,而Ntb HLH1和Nt MYB6共同存在下相互协作对Nt DFR激活能力最明显;单独转化Ntb HLH1和Nt MYB2都无法激活Nt LAR的活性,只有Ntb HLH1和Nt MYB2混合转化才能促进Nt LAR的表达。