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柯萨奇病毒 A 组 16 型(Coxsackievirus A16,CVA16)是引起手足口病(hand,footand mouth disease,HFMD)的主要病原体之一。主要感染5岁以下婴幼儿,症状主要有手、足、口腔等部位出现疱疹和斑丘疹,个别病例会出现无菌性脑膜炎、脑炎和心肌炎等。CVA16的基因组RNA编码一个开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF),分P1、P2和P3三个区域,P2编码非结构蛋白2A、2B和2C,P3区编码非结构蛋白3A、3B、3C和3D。病毒的非结构蛋白在病毒感染宿主细胞过程中发挥多种作用。本文采用酵母双杂交技术来筛选和3A与3B的前体蛋白3AB互作的宿主蛋白,以进一步了解3AB蛋白的功能和在CVA16感染宿主细胞过程中发挥的作用。本研究工作包括两部分:1、酵母双杂交筛选与3AB互作的宿主蛋白分别以实验室构建并保存的 pMD18-T-F4、pMD18-T-F5,pMD18-T-F6,pMD18-T-F7为模板扩增2A、2B、2C、3AB、3C、3D基因片段,将六个基因构建到酵母诱饵载体pGBKT7-BD上。重组诱饵表达载体电转化至Y2HGold酵母,筛选、鉴定阳性克隆。检测诱饵蛋白的细胞毒性作用,Western blot分析诱饵蛋白在酵母中是否表达,然后检测其转录激活作用。确定诱饵蛋白正常表达且没有毒性和自激活作用后后,进行酵母双杂交筛选。双杂交后的二倍体结合子涂布DDO/X/A平板,从该平板上挑取蓝色酵母菌落接种到QDO/X/A平板,从蓝色菌落拯救质粒,转化至DH5α,分别涂布Kan+、Amp+抗性平板,随机提取单菌落质粒,鉴定,测序。诱饵质粒与筛选到的文库质粒共转化Y2HGold酵母进行回复杂交验证,涂布QDO/X/A平板,提取蓝色菌落质粒,测序,Blast比对后,确定一种与3AB互作的靶蛋白:Acyl-CoA binding domain containing 3(ACBD3)。2、Co-IP验证3AB与靶蛋白ACBD3相互作用构建诱饵蛋白3AB与靶蛋白ACBD3的真核表达载体,pCDNA3.1-3AB-2×Flag、pCDNA3.1-ACBD3-2×HA,分别瞬时转染 HEK293T 细胞,Western blot 检测到 3AB 和ACBD3 在 HEK293T 细胞中均表达。pCDNA3.1-3AB-2×Flag 和 pCDNA3.1-ACBD3-2×HA共转染HEK293T细胞,免疫共沉淀验证了 3AB和ACBD3在HEK293T细胞中有相互作用。本论文采用酵母双杂交技术筛选到一个与3AB互作的靶蛋白ACBD3,回复验证正确。检测到两个蛋白在HEK293T细胞中均表达,通过Co-IP实验证明3AB与ACBD3在HEK293T细胞中有相互作用,为进一步研究3AB蛋白的功能以及ACBD3在CVA16感染过程中发挥哪些作用奠定了基础。