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内向整流钾通道(Inwardly rectifying potassium channel,Kir)作为钾通道中的一员,在控制静息电位、维持细胞内稳态和传导细胞兴奋性等方面起到重要的作用,也是开发新型治疗药物的重要靶标,甚至可作为新型杀虫剂靶标进行开发。本研究以农业害虫褐飞虱和甜菜夜蛾为研究对象,针对昆虫的内向整流钾通道在基因克隆、表达分析以及功能方面开展了初步探索。本研究克隆得到了褐飞虱和甜菜夜蛾中的内向整流钾通道基因,利用荧光定量PCR技术分析了其在褐飞虱和甜菜夜蛾不同发育阶段以及幼虫不同组织中的表达分布,通过将褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir1通道异源表达于HEK293细胞中,利用全细胞膜片钳技术检测了这两种昆虫Kir1通道的内向整流特性,并发现杀虫剂氟啶虫酰胺对Kir1通道的内向电流具有阻断效应。根据铊离子和钾离子具有等效性的特点建立了针对昆虫内向整流钾通道的高通量筛选技术-铊离子荧光法,可进行作用于内向整流钾通道药物的高通量筛选。一、褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的克隆和序列分析本研究中,我们得到了 3个褐飞虱的Kir基因和5个甜菜夜蛾Kir基因。在褐飞虱和甜菜夜蛾Kir基因的蛋白序列中均含有两个跨膜结构域(TM1、TM2),位于胞内的N-端和C-端以及两个跨膜域中间的孔区(H5),该孔区包含有孔螺旋特征序列“TXGYG”,控制钾离子选择性透过。通过与双翅目昆虫和人类Kir通道蛋白序列进行比对分析,褐飞虱和甜菜夜蛾的Kir基因分属于3个不同的亚家族Kir1、Kir2和Kir3。其中昆虫的Kir1亚家族都只含有1个基因;Kir2和Kir3亚家族在进化过程中有新成员出现,新基因的出现可能与昆虫进化过程中对外界环境的适应有关。二、褐飞虱和甜菜夜蛾Kir通道基因的表达模式通过荧光定量PCR技术,对褐飞虱和甜菜夜蛾中Kir基因进行了表达模式研究。褐飞虱的3个Kir基因中,Kir1基因在卵和若虫阶段的表达水平明显高于成虫阶段,Kir2和Kir3在若虫阶段的表达水平明显高于成虫和卵。在褐飞虱的各组织器官中,Kir通道的3个基因在头、腹部和触角的中表达水平较高,其中Kir1和Kir2在翅中的表达水平也较高。在对甜菜夜蛾不同发育阶段的研究中,Kir1、Kir2A和Kir3A在甜菜夜蛾的幼虫时期表达水平明显高于其他发育阶段,Kir2B和Kir3B在甜菜夜蛾卵中表达水平最高。在不同的组织表达量的结果中,Kir1通道在脂肪体中的表达水平较高,其他的Kir通道基因在中肠、后肠和马氏管中都有较高的表达。三、褐飞虱Kir1和甜菜夜蛾Kir1通道的内向整流特性为明确褐飞虱和甜菜夜蛾的内向整流钾通道的电生理特性,我们利用pEGFP-N1质粒,将褐飞虱Kir基因(N1Kir1)和甜菜夜蛾Kir基因(SeKir1)分别与增强型荧光蛋白进行融合表达,形成pEGFP-N1-N1Kir1和pEGFP-N1-SeKir1质粒,采用脂质体法瞬时转染至HEK293细胞中,使用全细胞膜片钳技术记录转染细胞钾电流。在表达N1Kir1和SeKir1通道的HEK293细胞上均能检测到典型的内向电流,并表现为整流特性。利用Kir的抑制剂BaC12溶液进行灌流后,能够显著减弱内向整流钾通道的电流,进一步证明了所记录的电流为内向整流钾通道电流。四、氟啶虫酰胺和呱虫啶对Kir通道的抑制作用通过测定杀虫剂对这两种昆虫内向整流钾通道电流的影响,表明氟啶虫酰胺和派虫啶对褐飞虱和甜菜夜蛾的内向整流钾通道都存在抑制作用并且表现出剂量依赖效应。其中氟啶虫酰胺对N1Kir1和SeKir1通道的IC50分别为0.64μM和0.16μM,;哌虫啶对N1Kir1和Kir1的IC50值分别为5.32 μM和3.37 μM,而吡蚜酮和吡虫啉在对这两种昆虫的内向整流钾通道即使在100μM时也不存在抑制作用。五、基于铊离子荧光技术的靶向昆虫Kir药物筛选平台建立了针对昆虫内向整流钾通道的高通量筛选技术-铊离子荧光检测法。该方法主要利用铊离子在钾通道的选择通过性上与钾离子相似的特性,根据铊离子与进入细胞内的荧光染料结合发荧光的特点,以荧光强度的大小测定内向整流钾通道的开放情况。本研究中建立了稳定转染N1Kir1和SeKir1通道的HEK293细胞系,测定得到了氟啶虫酰胺对N1Kir1通道和SeKir1通道的抑制中浓度分别为1.96μM和4.37μM;哌虫啶对N1Kir1通道和SeKir1通道的抑制中浓度分别为173.6μM和13.99μM。吡蚜酮和吡虫啉在高浓度时对SeKir1和N1Kir1也不存在抑制作用。