携带抗氧化基因的BMSCs对PQ所致小鼠肺损伤作用的研究

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xuejun2004
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目的:  通过构建百草枯所致的小鼠肺损伤模型,研究骨髓间充质干细胞及携带有抗氧化基因Nrf2、SOD的骨髓间充质干细胞对其的治疗作用及可能机制。  方法:  第—部分:  构建携带有Nrf2和SOD基因的过表达慢病毒并进行相关鉴定;培养、验证小鼠骨髓间充质干细胞;利用过表达抗氧化基因的慢病毒转染BMSCs,建立携带有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的BMSCs体系,并利用报告基因表达的樱桃红色荧光对其转染率进行鉴定,Western blot检测其蛋白水平的表达情况。  第二部分:  按照第一部分的方法大量培养BMSCs细胞体系、携带有空载基因的BMSC细胞体系、携带有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的BMSCs细胞体系等4组细胞体系作为治疗组;清洁级balb/c小鼠144只随机分为6组,每组24只:百草枯中毒组、BMSCs治疗组、携带空载基因的BMSCs治疗组、携带Nrf2基因的BMSCs治疗组、携带SOD基因的BMSCs治疗组和正常组。一次性腹腔注射百草枯溶液(25mg/Kg)构建小鼠百草枯中毒肺损伤模型,正常组给予等体积生理盐水;在注射百草枯溶液后4小时给予相应组别球后静脉注射相应的细胞体系;观察各组小鼠经不同处理方法后的行为学改变;分别在给予细胞治疗后的3、7、14、21天处死各组小鼠取相应肺组织标本,行HE染色病理组织学观察,电镜观察超显微结构结构损伤情况,Tunel技术观察肺组织凋亡情况,留取血液标本,用化学比色法检测SOD、MDA、GSH等相应的氧化应激指标,制备肺组织匀浆,用ELISA方法检测IL-1β、TNF-α、TGF-β等炎症指标,用Western Blot检测肺组织核磷酸化NF-κB亚基(P-p65)的表达情况。  结果:  1.通过荧光显微镜观察红色荧光表达情况,携带有抗氧化基因(Nrf2、SOD)的慢病毒转染BMSCs的转染率均达80%以上,Lv-Nrf2及Lv-SOD转染BMSCs后,通过Western blot检测其在BMSCs中实现了蛋白表达量明显升高(P<0.05)。  2.PQ中毒后,小鼠早期便出现了出现食欲下降、体重减轻、倦怠少动,反应迟缓,毛色干枯,呼吸急促等表现;但实施了BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs及携带有SOD基因的BMSCs静脉注射的小鼠上诉症状得到了明显改善。无论是干细胞还是抗氧化基因的作用,都可能对百草枯所致的肺损伤有治疗作用;  3.肺组织病理学结合电镜观察显示,与百草枯中毒组相比,实施了BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs及携带有SOD基因的BMSCs静脉注射的小鼠肺组织损伤程度大大减轻(P<0.05),而且携带有Nrf2基因的BMSCs的治疗效果更好(P<0.05)。  4.TUNEL检测结果显示,与百草枯中毒组相比,实施了BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs及携带有SOD基因的BMSCs静脉注射的小鼠肺组织的凋亡细胞阳性染色率明显降低(P<0.05),并且携带有Nrf2基因的BMSCs小鼠肺组织的凋亡细胞阳性染色率低于其他组别(PQ+BMSCs组、PQ+携带有空载基因的BMSCs组、PQ+携带有SOD基因的BMSCs组)。  5.Western blot结果显示,与正常组比较,PQ中毒时,Nrf2在第3天,第21天都有高表达(P<0.05),SOD在第3天有高表达(P<0.05),在第21天时其表达量无统计学差异(P>0.05)。与PQ中毒组相比,经BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs及携带有SOD基因的BMSCs治疗Nrf2、蛋白表达量在第3、21天都有升高(P<0.05),经BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs治疗的SOD蛋白表达量在第3天有升高(P<0.05),第21天时已经无统计学差异(P<0.05),但经携带有SOD基因的BMSCs治疗组在第3、21天SOD蛋白都有升高(P<0.05);与BMSCs、携带有SOD基因的BMSCs治疗组相比,携带有Nrf2基因的BMSCs治疗组Nrf2蛋白表达量更高(P<0.05)。  6.化学比色结果显示,与正常组相比,PQ中毒时MDA水平上升,SOD、GSH水平下降(P<0.05),而且在第3天、第7天大幅变动,之后随着时间延长不再出现趋势变动;BMSCs能在早期抑制这种趋势的发生(P<0.05),BMSCs与Nrf2的结合作用更具有统计学差异(P<0.05)。  7.ELISA结果显示,与正常组组比较,PQ组3d时TNF-α、IL-1β、IL-6明显升高(P<0.05),但随时间推移其变化不再明显;与PQ中毒组比较,BMSCs治疗组、携带Nrf2基因的BMSCs系治疗组、携带SOD基因的BMSCs系治疗组能缓解其上升幅度(P<0.05)。BMSCs组和携带Nrf2基因的BMSCs系治疗组两者之间对TNF-α、IL-1β指标的影响在3、7、14天,具有统计学差异(P<0.05),BMSCs组和携带SOD基因的BMSCs系治疗组两者之间对TNF-α、IL-1β指标的影响在3、7、14天,无统计学差异。  8.Western Blot检测肺组织核磷酸化NF-κB亚基(P-p65)结果显示,与正常组比较,PQ中毒后P-p65表达量在第3、7天显著升高(P<0.05);与百草枯中毒组比较,经BMSCs、携带有空载基因的BMSCs、携带有Nrf2基因的BMSCs及携带有SOD基因的BMSCs治疗的P-p65表达量在第3、7、14天有下降(P<0.05),并且携带有Nrf2基因的BMSCs的治疗组间在第21天仍具有统计学意义(P<0.05)。  结论:  1、BMSCs及携带有抗氧化基因的BMSCs能有效减轻PQ所致肺损伤;  2、携带有抗氧化基因的BMSCs比BMSCs更能有效减轻PQ所致肺损伤作用;  3、BMSCs及携带有抗氧化基因的BMSCs对PQ所致肺损伤的保护作用可能与体内氧化应激、炎症、抗炎因子等有关。
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