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近年来,犬细小病毒病已经成为高度威胁犬类健康的传染病,并且变异速率很高,新型毒株的产生对原有的疫苗免疫防控造成了新的挑战,新型的基因工程亚单位疫苗成为研究的热点之一。为提高犬细小病毒疫苗的免疫保护力,本研究以犬IL-2作为分子佐剂,与犬细小病毒VP2基因构建重组融合表达质粒,通过大肠杆菌原核表达系统表达重组蛋白。首先,本试验从疑似犬细小病毒感染犬的粪便分离出12株疑似毒株,经细胞分离、PCR扩增特异性片段、血凝试验、TCID50测定、理化特性试验,确定为犬细小病毒。对分离到的12株犬细小病毒VP2基因进行测序分析,分型结果表明,分离到5株New CPV-2a型毒株,4株New CPV-2b型毒株,3株CPV-2c型毒株。表明2a和2b型是吉林省地区犬细小病毒的主要流行亚型。核苷酸序列和推导出的氨基酸序列同源性分析表明,12株犬细小病毒VP2基因之间的核苷酸同源性为98.9%~99.9%,氨基酸同源性为99.0%~100%;与GenBank上登录的国内外近年来的毒株之间的核苷酸同源性为98.7%~100%,氨基酸的同源性为98.5%~100%。本试验以分离到的CPV-2c型JL-11株为研究对象,CPV-2c型自2010年在我国分离到之后不断进化、传播,现有的疫苗株是否对该型毒株具有较好的免疫预防作用尚不清楚。因此,研制一种针对2c型犬细小病毒的新型基因工程亚单位疫苗,具有一定临床应用价值。然后,设计引物时,在上下游引物中分别引入BamHⅠ、SacⅠ酶切位点,扩增CPV JL-11株VP2基因,序列大小为1770bp。从成年健康家犬外周血中分离淋巴细胞,使用刀豆蛋白A(ConA)进行诱导,提取诱导刺激后的致敏淋巴细胞总RNA,设计特异性引物,其中上游引入SacⅠ酶切位点和一段柔性linker,下游引入XhoⅠ酶切位点,扩增出犬IL-2基因编码序列,大小为501bp。利用BLAST软件与GenBank中已知的犬IL-2序列进行同源性对比,与已报道的犬IL-2序列相似度最高,同源性为99%~100%。最后,将VP2基因和犬IL-2基因序列进行双酶切后,先后与双酶切后的表达载体pET-28a连接,验证结果表明成功构建重组融合表达质粒pET-VP2-IL-2,重组融合表达质粒pET-VP2-IL-2转入Rosetta(DE3)后,使用IPTG作为诱导剂,通过对最佳诱导时间、最佳诱导浓度的摸索确立了最佳诱导条件,SDS-PAGE分析结果表明成功表达出融合蛋白,分子量大小约为82kDa。重组融合蛋白VP2-IL-2经Western Blot分析表明具有反应原性。本研究为新型犬细小病毒疫苗的研制提供了一定的试验基础。