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研究背景
环境空气中动力学当量直径≤2.5μm的空气悬浮颗粒物称为细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)，是主要空气污染物之一。PM2.5的人为因素来源主要是交通工具排放尾气和供热、烹饪过程燃料燃烧。生物燃料(如木材、秸秆等)是农村家庭的主要能源，其燃烧产生的烟雾是农村空气PM2.5的主要来源。暴露生物燃料烟雾可导致肺功能下降和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)。吸烟和大量接触PM2.5被确定为中国成年人COPD的主要可预防风险因素。近年来，PM2.5对COPD的作用备受关注。COPD病理改变中的气流受限不完全可逆与香烟烟雾和空气中有害颗粒物引起气道损伤，导致小气道(内径小于2mm)重塑有关。小气道重塑的病理学表现为气道炎症损伤，气管壁增厚变形和平滑肌层增厚，作为损伤修复作用的成纤维细胞增多并向肌成纤维细胞分化引起气道管径变窄，导致气管舒缩功能失调。气道重塑发生的一个重要原因是肌成纤维细胞增生，释放促纤维化因子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增加。钙离子(Ca2+)是肌成纤维细胞分化所必须的。基于以上研究背景，本课题组将评估PM2.5对气道重塑的影响和作用机制的研究，主要是人支气管成纤维细胞(Human Bronchial Fibroblasts HBF，HBF)向肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)分化研究。观察PM2.5刺激的HBF向MFB分化相关蛋白表达变化和细胞内Ca2+浓度变化，探究Ca2+浓度变化是否通过经典瞬时受体电位通道1(Transient Receptor Potential Canonical Channels， TRPC1)介导。PM2.5是否激活PI3K/AKT通路，从而探索PM2.5在COPD气道重塑的可能作用机制，为COPD的防治补充理论依据。
研究目的
1．在动物水平观察大鼠暴露在生物燃料烟雾不同时间后，肺部发生的病理改变情况。在细胞水平明确生物燃料PM2.5是否能诱导HBF向MFB分化。
2．观察PM2.5刺激对HBF内Ca2+的影响。
3．明确TRPC1是否参与PM2.5对细胞内Ca2+的影响，应用特异性小分子干扰RNA沉默TRPC1蛋白的表达，探索TRPC1是否参与肌成纤维细胞分化。
4．研究PM2.5致HBF向MBF分化与PI3K/AKT信号通路的关系。从而阐明PM2.5导致的HBF向MFB分化机制，阐述PM2.5导致COPD气道重塑的可能机制，为COPD防治提供新靶点。
研究方法
1.动物造模
将8周龄SD大鼠随机分为4组，分别是对照组、生物燃料烟雾组暴露4周和24周。暴露完成后取肺组织石蜡包埋，组织切片进行相关指标检测。
2.PM2.5采集和提取
使用PM2.5采样器配套玻璃纤维滤膜在南方农村厨房内采集空气PM2.5，用二甲基亚砜(DMSO)提取滤膜PM2.5可溶相。
3.细胞培养
购买的原代人支气管成纤维细胞(HBF)复苏传代培养，4~8代细胞用于实验。
4.CCK8法检测细胞活力
CCK8法检测浓度梯度PM2.5刺激HBF48h和72h后的细胞活力变化。
5.免疫印迹实验(western blot)检测蛋白表达
PM2.5刺激HBF72h提取细胞蛋白，westernblot检测α-SMA和COLⅠ变化情况，PM2.5刺激HBF24、48、72h，westernblot检测TRPC1蛋白变化情况，PM2.5刺激HBF15、30、60、120min，westernblot检测P-AKT表达情况。
6.细胞免疫荧光
PM2.5刺激HBF72h时采用细胞免疫荧光法检测α-SMA和COLⅠ蛋白和观察细胞形态改变。
7.胶原收缩实验
PM2.5刺激HBF72h后用胶原收缩试剂盒检测细胞收缩性改变。
8.siRNA转染
用特异性干扰TRPC1的siRNA抑制HBF中的TRPC1表达。
9.细胞内钙离子测定
利用Fluo-4AM钙离子染料，在激光共聚焦显微镜下记录细胞受到PM2.5刺激时各个时间点的荧光值，荧光值比值表示细胞内Ca2+相对浓度。
10.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR检测正常状态下的HBF中TRPC1、3、4、5、6、7的表达情况和经PM2.5刺激6、12、24、48h的TRPC1mRNA表达变化情况。
实验结果
1.在动物水平：观察到生物燃料烟雾暴露可导致大鼠气道炎症，暴露24周时，小气管壁增厚，出现小气道重塑现象。在细胞水平：生物燃料PM2.5能促进HBF向MFB分化，在48h开始α-SMA和Col-Ⅰ蛋白水平升高，72h更明显，细胞免疫荧光结果显示，生物燃料PM2.5刺激72h后的成纤维细胞，细胞形态发生了明显改变，大部分细胞由梭形转变成星形不规则形，胞质出现α-SMA应力纤维，Ⅰ型胶原蛋白合成增加。胶原凝胶收缩实验表明生物燃料PM2.5刺激成纤维细胞后，细胞的收缩力增强。
2.生物燃料PM2.5刺激能使HBF的TRPC1mRNA和蛋白表达水平升高，使用特异性siRNA-TRPC1可以抑制PM2.5诱导的HBF向MFB分化，细胞收缩性也受到一定程度的抑制作用。PM2.5能使细胞内Ca2+浓度升高，使用特异性siRNA-TRPC1可以降低细胞内Ca2+浓度。
3.生物燃料PM2.5刺激能使HBF的AKT磷酸化水平增加，使用PI3K抑制剂LY294002能抑制PM2.5导致的AKT磷酸化，并且抑制了HBF向MFB分化以及TRPC1蛋白升高。
结论
1.生物燃料PM2.5刺激能诱导HBF向MFB分化。
2.TRPC1调节生物燃料PM2.5引起细胞内Ca2+增加，促进HBF向MFB分化。
3.生物燃料PM2.5激活PI3K/AKT-TRPC1信号通路，调节HBF向MFB分化。
环境空气中动力学当量直径≤2.5μm的空气悬浮颗粒物称为细颗粒物(fine particulate matter，PM2.5)，是主要空气污染物之一。PM2.5的人为因素来源主要是交通工具排放尾气和供热、烹饪过程燃料燃烧。生物燃料(如木材、秸秆等)是农村家庭的主要能源，其燃烧产生的烟雾是农村空气PM2.5的主要来源。暴露生物燃料烟雾可导致肺功能下降和慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)。吸烟和大量接触PM2.5被确定为中国成年人COPD的主要可预防风险因素。近年来，PM2.5对COPD的作用备受关注。COPD病理改变中的气流受限不完全可逆与香烟烟雾和空气中有害颗粒物引起气道损伤，导致小气道(内径小于2mm)重塑有关。小气道重塑的病理学表现为气道炎症损伤，气管壁增厚变形和平滑肌层增厚，作为损伤修复作用的成纤维细胞增多并向肌成纤维细胞分化引起气道管径变窄，导致气管舒缩功能失调。气道重塑发生的一个重要原因是肌成纤维细胞增生，释放促纤维化因子和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)增加。钙离子(Ca2+)是肌成纤维细胞分化所必须的。基于以上研究背景，本课题组将评估PM2.5对气道重塑的影响和作用机制的研究，主要是人支气管成纤维细胞(Human Bronchial Fibroblasts HBF，HBF)向肌成纤维细胞(Myofibroblast，MFB)分化研究。观察PM2.5刺激的HBF向MFB分化相关蛋白表达变化和细胞内Ca2+浓度变化，探究Ca2+浓度变化是否通过经典瞬时受体电位通道1(Transient Receptor Potential Canonical Channels， TRPC1)介导。PM2.5是否激活PI3K/AKT通路，从而探索PM2.5在COPD气道重塑的可能作用机制，为COPD的防治补充理论依据。
研究目的
1．在动物水平观察大鼠暴露在生物燃料烟雾不同时间后，肺部发生的病理改变情况。在细胞水平明确生物燃料PM2.5是否能诱导HBF向MFB分化。
2．观察PM2.5刺激对HBF内Ca2+的影响。
3．明确TRPC1是否参与PM2.5对细胞内Ca2+的影响，应用特异性小分子干扰RNA沉默TRPC1蛋白的表达，探索TRPC1是否参与肌成纤维细胞分化。
4．研究PM2.5致HBF向MBF分化与PI3K/AKT信号通路的关系。从而阐明PM2.5导致的HBF向MFB分化机制，阐述PM2.5导致COPD气道重塑的可能机制，为COPD防治提供新靶点。
研究方法
1.动物造模
将8周龄SD大鼠随机分为4组，分别是对照组、生物燃料烟雾组暴露4周和24周。暴露完成后取肺组织石蜡包埋，组织切片进行相关指标检测。
2.PM2.5采集和提取
使用PM2.5采样器配套玻璃纤维滤膜在南方农村厨房内采集空气PM2.5，用二甲基亚砜(DMSO)提取滤膜PM2.5可溶相。
3.细胞培养
购买的原代人支气管成纤维细胞(HBF)复苏传代培养，4~8代细胞用于实验。
4.CCK8法检测细胞活力
CCK8法检测浓度梯度PM2.5刺激HBF48h和72h后的细胞活力变化。
5.免疫印迹实验(western blot)检测蛋白表达
PM2.5刺激HBF72h提取细胞蛋白，westernblot检测α-SMA和COLⅠ变化情况，PM2.5刺激HBF24、48、72h，westernblot检测TRPC1蛋白变化情况，PM2.5刺激HBF15、30、60、120min，westernblot检测P-AKT表达情况。
6.细胞免疫荧光
PM2.5刺激HBF72h时采用细胞免疫荧光法检测α-SMA和COLⅠ蛋白和观察细胞形态改变。
7.胶原收缩实验
PM2.5刺激HBF72h后用胶原收缩试剂盒检测细胞收缩性改变。
8.siRNA转染
用特异性干扰TRPC1的siRNA抑制HBF中的TRPC1表达。
9.细胞内钙离子测定
利用Fluo-4AM钙离子染料，在激光共聚焦显微镜下记录细胞受到PM2.5刺激时各个时间点的荧光值，荧光值比值表示细胞内Ca2+相对浓度。
10.实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR检测正常状态下的HBF中TRPC1、3、4、5、6、7的表达情况和经PM2.5刺激6、12、24、48h的TRPC1mRNA表达变化情况。
实验结果
1.在动物水平：观察到生物燃料烟雾暴露可导致大鼠气道炎症，暴露24周时，小气管壁增厚，出现小气道重塑现象。在细胞水平：生物燃料PM2.5能促进HBF向MFB分化，在48h开始α-SMA和Col-Ⅰ蛋白水平升高，72h更明显，细胞免疫荧光结果显示，生物燃料PM2.5刺激72h后的成纤维细胞，细胞形态发生了明显改变，大部分细胞由梭形转变成星形不规则形，胞质出现α-SMA应力纤维，Ⅰ型胶原蛋白合成增加。胶原凝胶收缩实验表明生物燃料PM2.5刺激成纤维细胞后，细胞的收缩力增强。
2.生物燃料PM2.5刺激能使HBF的TRPC1mRNA和蛋白表达水平升高，使用特异性siRNA-TRPC1可以抑制PM2.5诱导的HBF向MFB分化，细胞收缩性也受到一定程度的抑制作用。PM2.5能使细胞内Ca2+浓度升高，使用特异性siRNA-TRPC1可以降低细胞内Ca2+浓度。
3.生物燃料PM2.5刺激能使HBF的AKT磷酸化水平增加，使用PI3K抑制剂LY294002能抑制PM2.5导致的AKT磷酸化，并且抑制了HBF向MFB分化以及TRPC1蛋白升高。
结论
1.生物燃料PM2.5刺激能诱导HBF向MFB分化。
2.TRPC1调节生物燃料PM2.5引起细胞内Ca2+增加，促进HBF向MFB分化。
3.生物燃料PM2.5激活PI3K/AKT-TRPC1信号通路，调节HBF向MFB分化。