背景:膝关节在运动或高速撞击中易受到损伤,尤其以韧带损伤、软骨损伤及关节周围骨折最为常见。若不开展有效治疗,严重者将导致膝关节关节炎、骨折畸形愈合及不愈合等并发症。膝关节损伤的手术修复治疗中,相关骨科内植物的应用对修复的效果至关重要。以前交叉韧带(Anterior cruciate ligament,ACL)撕裂为例,在重建ACL过程中,需采用界面螺钉植入骨隧道内对移植物进行固定,以保证移植物的稳定性,促进腱骨愈合,重塑ACL功能。术中常用的界面螺钉材料多为生物可吸收性高分子聚合物如聚乳酸(Polylactic acid,PLA)或联合无机材料如羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)等。相关临床研究发现部分病例中PLA螺钉术后在骨隧道内完全降解需要7至10年的时间。较低的降解速率使界面螺钉在骨隧道内占位,影响隧道内新生骨形成从而阻碍了腱骨愈合效果。而对于膝关节周围骨折尤其是股骨远端粉碎性骨折及胫骨平台骨折,多需要植入骨移植物进行修复以进行骨缺损治疗,防治骨折畸形愈合或者骨不连。然而自体骨或异体骨移植以及人工合成的骨移植物因其各自并发症限制其在临床上广泛应用。可见膝关节损伤修复的内植物仍存在诸多缺陷,亟待改进。近年来,三维打印(three-dimensional printing,3D printing)技术在医疗领域蓬勃发展,主要是取决于其个性化定制、可操作性、可实现多种材料制造等诸多优点。在外科手术中,3D打印技术目前主要以模型术前规划,导板术中定位,假体术中植入的应用最为广泛。因此针对上述膝关节损伤修复中如ACL重建界面螺钉及膝关节周围骨折骨移植物的不足,本课题组希望通过能借助3D打印技术,尤其是最近广泛普及的桌面3D打印机,利用其成本低,易操作,应用材料广泛的特点来对以上两种损伤修复的内植物进行改进,使其表现出更好的修复性能。在运用临床上常规材料PLA及HA根据ACL重建模型制造多孔的界面螺钉支架联合负载骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)用于 ACL 重建修复的同时着眼于新型打印材料用于打印骨移植物支架的强度改进,使其可用于关节周围骨折缺损填充修复,主要内容围绕下述几个方面展开:1、3D打印PLA界面螺钉支架制造及体外生物学特性;2、PLA/HA界面螺钉支架复合BMSCs重建兔ACL;3、高强度3D打印掺镁硅酸钙支架的制备及理化特性;4、高强度3D打印掺镁硅酸钙支架修复兔膝关节周围骨缺损。第一部分3D打印PLA界面螺钉支架制造及体外生物学特性目的通过3D打印机设计制备PLA界面螺钉支架,HA对其进行表面修饰,并检测螺钉支架负载细胞的生物学性能。方法·依据新西兰大白兔前交叉韧带重建模型设计PLA界面螺钉支架并通过3D打印机进行制造。利用化学共沉淀方法合成HA粉体,X射线衍射(XRD)鉴定材料成分。通过层层静电组装法对PLA界面螺钉支架进行表面修饰制得PLA/HA螺钉支架,运用扫描电子显微镜(SEM)观察修饰前后支架的表面形态,通过排水法测定螺钉支架的孔隙率。将兔BMSCs分别与PLA,PLA/HA螺钉支架共培养(PLA组,PLA/HA组),同时用Pluronic F-127凝胶负载BMSCs后与PLA-HA支架共培养(PLA/HA+PluronicF-127组)。通过SEM观察三组细胞形态,细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定三组细胞增殖情况,PCR检测三组成骨指标的表达情况。结果通过3D打印机制备PLA界面螺钉支架符合设计要求,支架内空道均匀分布,相互连通的,孔径约为290 ±16 μm,孔隙率为42 ±5%。合成HA晶体的直径约200nm。经表面修饰后HA在PLA/HA螺钉支架中均匀分布。相较于PLA组和PLA/HA组,PLA/HA+PluronicF-127组表现出良好的细胞形态,最高的增殖性能及最佳的成骨分化性能。结论通过3D打印及表面修饰成功制备PLA/HA界面螺钉支架。利用Pluronic F-127凝胶负载细胞构建PLA/HA螺钉支架BMSCs复合体,生物活性良好。为在ACL重建中,利用PLA/HA螺钉支架BMSCs复合体进行ACL修复提供了可能。第二部分PLA/HA界面螺钉支架复合BMSCs重建兔ACL目的将Pluronic F-127凝胶负载BMSCs种植于PLA/HA螺钉支架上,观察其用于兔ACL重建自体肌腱移固定后骨隧道骨量变化及腱骨界面愈合情况。方法将36只新西兰雄性大白兔随机平均分为三组,利用自体肌腱进行双侧ACL重建,股骨侧隧道中置入螺钉支架固定肌腱:PLA组,以单纯PLA螺钉支架进行固定;PLA/HA组,以单纯PLA/HA螺钉支架进行固定;BMSCs组,Pluronic F-127凝胶负载BMSCs种植于PLA/HA螺钉支架后进行固定。术后4周,12周分别行MRI扫描,观察骨隧道内螺钉支架的情况;行Micro-CT扫描,分别测量各组股骨骨隧道的成骨情况;硬组织切片进行组织学检测,观察各组股骨骨隧道内腱骨愈合情况。结果MRI显示各组螺钉支架沿轴向位于股骨隧道中,无断钉及其他并发症出现。术后4周、12周,BMSCs组股骨隧道内感兴趣区骨形成指标(BV/TV,Tb.N,Tb.Th,Tb.Sp)均高于PLA及PLA/HA组,新生骨沿螺钉孔道在骨隧道内均匀分布。尤其是在术后12周,BMSCs组新生骨相互连接形成一个类似螺钉支架的三维立体结构。硬组织切片组织学显示,相较于PLA及PLA/HA组,BMSCs组术后4周腱骨界面内呈现出较多的软骨样细胞表现,术后12周腱骨整合良好,有更好的细胞形态排列及细胞外基质沉积。结论PLA/HA界面螺钉支架复合BMSCs用于兔ACL重建不仅起到自体肌腱固定作用,同时可对ACL重建进行修复,有效增加骨隧道内新生骨量,形成稳定的腱骨愈合界面。第三部分高强度3D打印掺镁硅酸钙支架的制备及理化特性目的 合成掺镁硅酸钙粉体(CSi-Mg),并运用3D打印机制备全新高强度掺镁硅酸钙多孔支架,并对该支架的微观结构,力学性能,体外生物降解性等进行探究。方法化学沉淀法制备含镁摩尔比例为10%的掺镁硅酸钙粉(CSi-Mg10),同时制备纯硅酸钙粉(CSi)及β-磷酸三钙粉(β-TCP)作为对照。运用XRD检测材料成分。称取上述三种材料各5.0 g分别与4.0 g 6%聚乙烯醇溶液均匀混合后制成三种生物陶瓷墨水,进行挤出式3D打印,制得三种支架((?)6×6 mm)。60 ℃干燥过夜后1100 ℃ 一步烧结3小时。排水法计算支架孔隙率,SEM检测支架微观结构。将支架置于模拟体液SBF中,于相应时间点测定三种支架的抗压强度,弹性模量。将支架置于Tris-Hcl缓冲液中,通过检测各时间点支架重量的损失及溶液中pH值,Ca,Si,Mg的浓度,评估材料降解过程中周围环境的变化。结果三种生物陶瓷支架孔径均约为350 μm,孔道相互连接,孔隙率均超过50%。CSi-Mg10支架初始抗压强度显著(～115 MPa),分别超过CSi的4倍(～26 MPa),TCP的10倍(～11MPa)。18周后,CSi-Mg10支架架(～36M0)相较于另外两种(<9 MPa)依然保持较高的抗压强度。此外,相较于CSi过快降解的劣势,CSi-Mg10支架体外降解速率相对偏慢,随时间推移逐渐适量释放出Ca,Si及Mg成骨活性成分。结论本实验通过3D打印成功制备全新高强度掺镁硅酸钙多孔支架,表现出更佳的体外力学强度变化及生物降解特性,为骨缺损修复尤其是负重区骨修复材料领域提供了 一个新方向。第四部分高强度3D打印掺镁硅酸钙支架修复兔膝关节周围骨缺损目的利用3D打印掺镁硅酸钙多孔支架与成骨细胞共培养,探究支架对体外细胞增殖和成骨分化的作用。通过股骨髁缺损模型植入支架进行兔膝关节周围骨缺损修复,探究支架的成骨能力,降解特性及体内力学变化。方法将MC3T3细胞系分别与3D打印β-TCP,CSi和CSi-Mg10多孔支架共培养后使用SEM及细胞骨架染色观察细胞形态;使用CCK-8检测细胞增殖性能及PCR评估支架的成骨性能。在兔膝关节周围骨缺损修复中,36只大白兔随机平均分为三组(β-TCP组,CSi组,CSi-Mg10组),进行双侧股骨髁骨缺损修复。术后6周,12周,18周分别行行Micro-CT扫描,分析支架成骨能力;行硬组织切片进行组织学检测,荧光双标计算钙沉积速度(MAP),观察新生骨,支架降解情况;使用能谱扫描(EDS)检测磷灰石相的转化过程;于对应时间点测定体内支架的抗压强度。结果体外生物学检测中,CSi-Mg10组相较于CSi组细胞形态及成骨能力均无显著性差异(p>0.05),均显著高于β-TCP组(p<0.05)。在膝关节周围骨缺损修复实验中,CSi-Mg10组新生骨加速生长,在术后18周与CSi组新生骨量无显著性差异,同时仍保持着与缺损区骨相符的抗压强度(10-15MPa)和弹塑性力学反应。然而,β-TCP组成骨显著迟缓且β-TCP组与CSi组力学强度较低(<10 MPa)。结论本实验成功应用高强度3D打印掺镁硅酸钙多孔支架进行兔关节周围骨缺损修复,该支架在有效增加新生骨量的同时,依然保持了良好的力学性能,或可成为一种具有潜力的临床骨修复植入材料。