KLF4在leptin调控摄食行为中的作用及其机制研究

来源 :吉林大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xulxulo
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背景:瘦素(leptin)是由白色脂肪细胞分泌的一种具有调控能量代谢作用的激素因子。以往证据显示,在下丘脑中,leptin能够通过LR-JAK2-STAT3信号通路和PI3K-AKT信号通路调控摄食行为。Leptin直接作用于表达LR的突触前GABA能神经元,降低GABA能神经元对突触后POMC神经元的抑制作用。我们的前期研究发现,leptin可以抑制能量限制诱导的摄食量增加,此作用被GABA-B受体拮抗剂所阻断。GABA能神经递质传递系统在leptin的中枢摄食行为调控中发挥重要作用,但其具体机制尚不完全清楚。KLF4是锌指型转录因子家族的成员。KLF4最初从胃肠道中被发现,其在脂肪细胞分化过程中发挥重要的作用。后来发现,KLF4广泛参与中枢神经发育、神经分化、神经损伤修复等过程。我们的前期研究报道:KLF4协同戊巴比妥调控下丘脑GABA能系统,诱导下丘脑c-Fos表达,进而发挥镇静作用。然而目前未见有关KLF4对能量限制(禁食16小时)小鼠摄食行为的调控的报道以及探究KLF4在leptin调控摄食行为中的作用机制的实验。基于以上背景,本研究将对KLF4在能量限制和leptin对小鼠摄食行为调控中发挥的作用展开实验,我们将采用行为药理学、分子生物学、免疫组织化学和小鼠脑立体定位注射干扰病毒sh KLF4等实验手段,围绕LR-JAK2-STAT3信号通路、PI3K-AKT信号通路、下丘脑GABA能系统,对可能的调控机制进行探讨,进一步明确摄食行为中枢调控的分子机制,为肥胖、糖尿病等摄食行为异常的代谢类疾病提供一个可能的分子靶点。目的:本研究以能量限制(禁食16小时,下同)小鼠为模型,采用行为药理学、分子生物学和免疫组织化学等实验方法,探讨能量限制模型中leptin调控小鼠摄食的分子机制,以及KLF4在leptin调控摄食行为过程中发挥的作用。本研究为阐明leptin调控摄食行为的作用机制提供新的理论依据。方法:首先,考察能量限制对小鼠摄食的影响及其机制。将雄性小鼠随机分为两组:对照组和禁食组。按照分组取走禁食组的鼠粮,在16小时后,分别测定两组小鼠的摄食量,取小鼠相应的脑组织。通过免疫印迹实验考察KLF4水平变化以及leptin信号通路蛋白,POMC和TH表达水平的变化。为了探究能量限制与GABA神经元的关系,实验还检测了谷氨酸脱羧酶:GAD65和GAD67表达水平的变化。其次,考察leptin对小鼠摄食的影响。将禁食小鼠随机分三组:fasting+saline组,fasting+1mg/kg leptin组,fasting+2mg/kg leptin组。腹腔给药后即开展行为药理学实验考察不同剂量leptin对小鼠摄食量的影响。使用免疫印迹实验,分析对下丘脑和脑干KLF4和相关蛋白表达水平产生显著影响的leptin剂量。最后,基于已经成功构建的能量限制模型和选取的leptin剂量,考察KLF4在leptin调控小鼠摄食行为过程中发挥的作用及其机制。通过脑立体定位仪向侧脑室注射干扰病毒sh KLF4,使KLF4表达降低,其余小鼠侧脑室注射control病毒作为对照组。待病毒转染成功后,选取体重相近的control小鼠和sh KLF4小鼠,随机分组为:control+saline组,control+leptin组,sh KLF4+saline组,sh KLF4+leptin组。在禁食16小时后,根据分组腹腔注射leptin或生理盐水。随机选择小鼠进行行为学实验,其余小鼠取脑组织和血液。通过免疫印迹实验对leptin信号通路蛋白,GAD65,GAD67,POMC,TH表达水平进行检验,选取相关脑区进行免疫荧光实验检测POMC表达。通过免疫组织化学染色的方法,考察相关脑区c-Fos(神经元活化的蛋白标记)的表达量,探究KLF4作用的靶部位。检测不同组血糖之间的差异,并通过ELISA实验检测血浆中胰岛素含量的差异。结果:针对能量限制小鼠模型的研究结果表明,禁食结束后的0-0.5小时,0.5-1小时中,小鼠摄食量显著提升。能量限制导致脑干和下丘脑LR,p-JAK2,p-STAT3,PI3K,AKT表达水平显著下降,POMC水平显著降低,TH表达量显著上升,KLF4水平提升。同时,能量限制导致脑干和下丘脑GAD67水平显著上升,下丘脑GAD65水平显著上升。探究不同剂量leptin对摄食行为的影响及其分子机制的结果表明,leptin可以在0-0.5小时,0.5-1小时阶段降低能量限制引起的摄食量增加。1mg/kg leptin显著改变脑干p-STAT3,AKT以及GAD65,GAD67水平。脑干POMC表达水平在leptin作用下显著增加。然而leptin未引起脑干KLF4显著变化。针对下丘脑的实验结果显示,1mg/kg leptin最为显著地引起下丘脑leptin信号通路蛋白LR,p-JAK2,p-STAT3和AKT水平提升。同时,1mg/kg leptin组对下丘脑KLF4,GAD65和GAD67,POMC和TH水平产生显著影响。探究KLF4在leptin调控小鼠摄食行为过程中发挥的作用及其机制的结果显示,禁食结束后的0.5-1小时内,KLF4水平降低逆转了leptin引起的食物摄入减少。相对于对照病毒,sh KLF4病毒转染后,脑干和下丘脑KLF4水平显著下降。而KLF4并没有影响leptin对脑干LR,p-JAK2,p-STAT3,PI3K和AKT,GAD65和GAD67以及POMC和TH的作用。在下丘脑中,leptin对LR,p-JAK2,PI3K和AKT的作用并未受sh KLF4影响。sh KLF4对p-STAT3表达量没有影响,但是leptin对p-STAT3的作用被sh KLF4阻断。同时,sh KLF4阻断leptin对GAD65和POMC的作用。sh KLF4降低下丘脑TH的水平,但是并未对leptin引起的TH表达量降低产生影响。在下丘脑DM区和LH区中,持续的低KLF4水平阻断了leptin对神经元的抑制作用。在下丘脑弓状核和AHP中,leptin影响cfos表达,但KLF4并没有这种作用。而在VMH中,leptin和KLF4并没有对神经元产生影响。在能量限制模型中,血清胰岛素的水平仅受到leptin的调控,KLF4对其并没有影响。KLF4和leptin都未影响血糖值。结论:1.能量限制通过抑制leptin信号通路,激活GABA系统,进而促进摄食。而leptin给药逆转能量限制对摄食行为的促进作用。2.KLF4通过p-STAT3-POMC通路与GABA系统的谷氨酸脱羧酶对leptin调控的摄食行为产生影响。3.KLF4介导leptin对下丘脑DM和LH核团神经元及POMC神经元的激活。
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