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microRNAs是一类内源性,长约21nt的非编码小分子RNA。研究表明miRNA作为一类负调控因子广泛参与到植物生长发育的各种进程中。近几年来,高通量测序技术的广泛利用,使植物中大量的miRNA被发现和鉴定,这大大扩展了植物miRNA群体中miRNA的种类和数量。然而,红麻作为重要的韧皮纤维作物,目前还没有关于红麻miRNA的报道。本研究以红麻不育系UG93A和保持系UG93B花药为样品,分别建立small RNA文库,使用高通量测序技术鉴定红麻保守的miRNA和新的miRNA,对不育系和保持系花药中的miRNA的表达谱进行分析,并对它们的靶基因进行预测,最后对红麻miR394a,miRn20,miR167b的功能进行进一步的研究,初步研究结果如下:1.通过高通量测序获得了 42个保守的miRNA和41个新的miRNA。其中有14个miRNA在UG93A和UG93B的花药中差异表达。使用Targetfinder软件对miRNA进行靶基因预测,共预测到280个靶基因,其中差异表达的miRNA的靶基因有79个。通过生物信息学分析,发现这些靶基因大部分为转录因子,如SPL转录因子、GATA转录因子、亮氨酸拉链转录因子、NAC转录因子。此外,还有一些酶,如钙离子转运ATP酶、肉桂醇脱氢酶、糖基转移酶等。2.以红麻H3基因作为内参基因,随机挑选10个miRNA,采用荧光染料嵌合法(qRT-PCR)对高通量测序结果进行验证分析。结果表明,高通量测序结果可靠。3.以DNA为模板克隆miR394a,miRn20,miR167b前体基因序列。使用mfold在线软件分析,发现其前体序列能形成稳定的二级结构。采用双酶切法成功构建miR394a,miRn20,miR167b的过表达载体。4.利用改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,采用Golden Gate Cloning 方法分别构建 miR394a,miRn20,miR167b 的pYLCRISPR/Cas9 载体,将其分别命名为:pCas9-miR394,pCas9-miRn20,pCas9-miR167。使用酶解法分离红麻叶片原生质体,分别将构建好的三个Cas9载体转入红麻叶片原生质体中进行瞬时表达,测序结果表明:pCas9-miR394,pCas9-miRn20在红麻原生质体中具有靶向切割活性。5.利用烟草的遗传转化体系,使用农杆菌介导叶盘法将构建好的miR394a、miRn20、miR167b过表达载体转入烟草中进行功能研究,通过分子检测获得一批miR394a、miRn20、miR167b转基因植株。观察这3类植株目前的表型,两株miR394a转基因苗表现为植株矮小,叶片小且厚实,叶片颜色深绿,其它转基因苗与野生型相比没有明显差异,营养生长均正常。