家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目昆虫的模式生物,因其能够吐丝结茧,所以具有非常重要的经济价值。丝腺是家蚕唯一的吐丝器官,根据其结构和功能分为前部丝腺、中部丝腺、后部丝腺,后部丝腺分泌丝素蛋白,中部丝腺分泌丝胶蛋白,前部丝腺不分泌蛋白。从丝腺横切面来看,丝腺细胞内侧有一层内膜结构,这层结构主要由几丁质和蛋白质构成,在前部丝腺较厚,中部丝腺和后部丝腺较薄。内膜上面有孔道,细胞分泌的蛋白通过孔道进入丝腺腔内,丝素蛋白由后部丝腺分泌往前运输到中部丝腺,丝胶蛋白裹在丝素蛋白的外侧一起运输通过前部丝腺而分泌出丝腺转变为丝纤维。丝蛋白在向前部丝腺的运输的过程中,丝腺内膜能够为丝蛋白的构象转变提供巨大的剪切力,同时保护丝腺细胞不受到剪切力的破坏。目前的研究发现丝腺内膜的主要组成成分是几丁质和蛋白质,但是关于其中蛋白质的成分以及蛋白质与几丁质相互作用的研究很少。有研究者分别通过转录组学和蛋白质组学技术在前部丝腺鉴定到了53个和33个表皮蛋白,但作者并没有验证这些蛋白质能否与几丁质结合,和中部丝腺以及后部丝腺相比,前部丝腺内膜的蛋白质组分有什么不同之处呢?家蚕表皮和围食膜也是典型的由几丁质和蛋白共同作用形成的膜结构,它们与前部丝腺的内膜结构有什么差异?为了阐明这些问题,本研究首先通过扫描电镜和免疫荧光技术对丝腺前、中、后各个区段的内膜结构进行了观察;利用几丁质亲和层析和LC-MS/MS技术对丝腺几丁质结合蛋白进行了提取和鉴定,并与表皮和围食膜的几丁质结合蛋白进行对比,揭示了丝腺内膜的特殊之处;根据质谱结果分析选择了CPAP家族的表皮蛋白BmCPAP3进行了深入的研究:进行生物信息分析,克隆表达,并制备了多克隆抗体,对其进行了组织和时期表达特征分析,测定了其与几丁质的结合方式。主要研究结果如下:1.家蚕丝腺内膜结构的观察我们首先利用扫描电镜技术对家蚕五龄第5天丝腺的五个区段(前部丝腺、中部丝腺前区、中部丝腺中区、中部丝腺后区、后部丝腺)进行了观察,在前部丝腺的细胞层内侧能看到一层致密的结构,并且由前部丝腺的前端到后端这层结构越来越薄,在中部丝腺和后部丝腺看不到这层结构。随后,通过免疫荧光的技术对丝腺的几丁质进行染色,同样发现前部丝腺的内膜结构比较厚,位于细胞层内侧,而在中部丝腺和后部丝腺也能看到在细胞层内侧有很薄的几丁质层。2.家蚕不同丝腺几丁质结合蛋白的提取、鉴定通过几丁质亲和层析的技术对不同区段的丝腺的几丁质结合蛋白进行了提取,并利用lc-ms/ms技术对这些蛋白进行了鉴定。结果显示,在家蚕丝腺中能与几丁质结合的蛋白主要为表皮蛋白,还包括一些酶类、未知功能蛋白等。表皮蛋白主要包括cpr家族、cpap家族、cph家族、cpg家族,其中cpr家族的表皮蛋白在数量和结合丰度上都最高,其次是cpap家族。从丝腺的不同区段来看,前部丝腺几丁质结合蛋白的相对丰度相比于中部丝腺和后部丝腺要高很多。从不同家族的表皮蛋白来看,r&r-2结构域和cpap家族的表皮蛋白在前部丝腺丰度比较高,在中部丝腺和后部丝腺很低,而r&r-1结构域的表皮蛋白在中部丝腺较高,在前部丝腺中很低。通过将丝腺的几丁质结合组分与表皮、围食膜的对比发现,丝腺几丁质结合蛋白的种类与表皮更为相似,而与围食膜的差异很大。有研究发现,r&r-2结构域的表皮蛋白参与了硬表皮的形成,r&r-1结构域的表皮蛋白参与了软表皮的形成,而cpap家族的表皮蛋白与r&r-2结构域的表皮蛋白的定位情况高度一致,因此,我们推测前部丝腺腔内的r&r-2和cpap家族的表皮蛋白通过与几丁质结合形成了前部丝腺的内膜,赋予了其较高的硬度,为丝蛋白构象的转变提供了剪切力,也为前部丝腺的细胞提供了有效的保护。3.bmcpap3的原核表达与纯化、表达特征分析及与几丁质结合方式探究通过对bmcpap3基因进行生物信息学分析,发现其具有信号肽,分子量为27kda,等电点为4.82,由三个相同的chtbd2结构域组成。根据bmcpap3的序列设计引物进行克隆,将片段连接到pet28a载体上构建原核表达载体,将载体转入表达菌株transetta中进行原核表达,获得了有活性的bmcpap3重组蛋白,经过质谱鉴定是目的蛋白后,制备了多克隆抗体。利用rt-pcr和westernblotting的方法对BmCPAP3的组织和时期表达谱进行了检测,发现转录水平和蛋白水平的结果一致,从各组织表达特征来看,BmCPAP3在丝腺中的表达量比在头和表皮中的表达量低;从不同时期的丝腺的表达特征看,在眠期和起蚕期表达量最高,在其余时期的表达量均比较低;从不同时期的表皮表达特征来看,随着家蚕幼虫的发育BmCPAP3的表达量呈逐渐下降的趋势。为了探索CPAP家族的表皮蛋白是如何与几丁质进行结合的,我们对BmCPAP3蛋白进行分析,其由3个相同的结构域构成,我们分别对其结构域进行原核表达,表达出了有活性的结构域3、结构域1-2、结构域2-3,并将原核表达的结构域进行几丁质亲和层析验证。结果显示,结构域3、结构域1-2、结构域2-3均能够与几丁质进行结合,但是结合能力有差异,两个结构域比单个结构域结合几丁质的结合能力要强很多。