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黄单胞菌属(Xanthomonas)细菌是一类革兰氏阴性植物病原菌,该属的大多数成员能够侵染许多重要农作物,引发病害,例如:水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病、十字花科植物黑腐病和棉花角斑病等。黄单胞菌侵染可以导致农经作物严重减产,造成重大经济损失。
几乎所有黄单胞菌产生一种附膜的非水溶性黄色素,学名为菌黄素。菌黄素可以保护菌体免受光氧化造成的损伤,有效促进细菌在寄主植物上的附生及存活。菌黄素具有高度抗氧化能力,能够帮助细菌抵御寄主植物的防御系统,因此与细菌的侵染致病能力相关。近期研究发现:黄单胞菌产生一种可扩散的信号因子DF(diffusible factor),调控菌黄素的生物合成,从而影响菌株的致病性。初步分析表明:DF是一种丁酰内酯(butyrolactone),但此推测近期被否定。
本研究以十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv.campestris(Xcc)为模式菌株,从生物学和化学两个角度:
(1)鉴定DF分子的化学结构;
(2)研究DF的生物学功能;
(3)深入研究DF合成相关蛋白XanB2的生化功能、酶促催化活性和机理;
(4)解析DF生物合成途径。
首先,通过定点基因敲除,我们得到了DF缺陷型突变体△xanB2,建立了快速检测DF的报告系统。随后运用萃取、硅胶柱层析和高效液相色谱(HPLC)等分离方法,从Xcc发酵上清液中提取和纯化DF,再通过质谱(MS)和核磁共振(NMR)分析,鉴定DF化学结构为3-羟基苯甲酸(3-hydroxybenzonic acid)和4-羟基苯甲酸(4-hydroxybenzonic acid)。此外,表型分析揭示:DF与细菌存活率、抗氧化性及系统侵染能力相关。
进一步研究发现DF是通过莽草酸途径合成的。DF生物合成酶XanB2能够利用莽草酸途径的最终产物分支酸为前体合成3-HBA和4-HBA。XanB2包含三个结构域,其C-末端是一个类YjgF结构域,负责3-HBA的生物合成;而其N-末端结构域包含一“FGFG”motif,负责4-HBA的生物合成,是一个结构新颖的双功能酶。实验结果显示:3-HBA参与菌黄素生物合成,而4-HBA与辅酶Q生物合成相关。
Xcc基因组包含大肠杆菌CoQ8合成所需基因的同源基因ubiABEFGH,却没有编码合成4-HBA所必需的基因ubiC和脱羧酶基因ubiD。本研究表明:Xcc通过XanB2合成4-HBA作为CoQ8合成前体,这是一个CoQ生物合成的新途径。综上所述,XanB2是一个关键的代谢酶,负责将莽草酸途径与辅酶Q和菌黄素生物合成途径衔接起来。这种CoQ8生物合成新途径、菌黄素合成基因簇和XanB2同源蛋白存在于Xanthomonas、Xylella、Xylophilus、Pseudoxanthomonas Rhodanobacter、Frateuria、Herminiimonas和Variovorax属中,证实了这种机制的保守性。