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研究背景骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。骨肉瘤的治疗方案主要包括手术,新辅助化疗和辅助化疗,在标准治疗方案下非转移性骨肉瘤患者的五年生存率保持在70%左右。但转移性患者的预后降低,对初始治疗的反应不佳,5年总生存率低于25%。顺铂(DDP)为主的化疗方案是骨肉瘤的标准治疗方案。化疗耐药性,尤其是顺铂耐药性是骨肉瘤复发和预后的主要挑战。研究报道有很多机制可以导致化疗耐药,包括减少药物流入、增加药物流出、解毒系统的激活、药物靶点的改变、增强DNA修复、细胞凋亡受损和癌基因表达的改变。因此,迫切需要寻找一种可以有效影响骨肉瘤化疗耐药性和改善预后的新型生物标志物。微管亲和调节激酶2(MARK2)是MARK家族成员之一,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在神经分化、神经变性、细胞极化、细胞内转运和细胞迁移等方面发挥重要作用。近年来的研究发现,MARK2与肿瘤的恶性生物学行为和耐药性密切相关。在顺铂耐药的Hela细胞株中发现了 MARK2的过度表达。MARK2基因沉默后,宫颈癌细胞对顺铂的敏感性增加,但对长春新碱和紫杉醇的敏感性没有明显变化。MARK2与非小细胞肺癌的DNA损伤反应和顺铂耐药相关。然而,MARK2在骨肉瘤顺铂耐药中的作用及机制尚不清楚。增加药物外排和抑制细胞凋亡是化疗耐药的两个重要原因。P-糖蛋白(P-gp)是一种跨膜糖蛋白,被认为是一种能量依赖性药物外排泵,可降低细胞内化疗药物浓度。越来越多的证据表明P-gp的过度表达在肿瘤的多药耐药中起重要作用。此外,研究表明P-gp的高表达与骨肉瘤的化疗耐药有关,并与预后不良有关。细胞凋亡是化疗诱导细胞死亡的主要方式,而且研究表明,凋亡相关基因p53、BCL-2、BAX等的表达与骨肉瘤的细胞耐药有关。先前的研究表明,在很多肿瘤中,P-gp的表达与化疗耐药相关,并且受PI3K/AKT/NF-κB通路的调控。此外,研究表明AKT/NF-κB通路参与调节骨肉瘤的耐药性。然而,MARK2是否通过PI3K/AKT/NF-κB信号途径调节P-gp的表达和细胞凋亡从而促进骨肉瘤细胞对顺铂的耐药,尚待进一步研究。研究目的化疗耐药是骨肉瘤治疗和预后的主要临床挑战。本研究旨在探讨MARK2在骨肉瘤顺铂耐药中的作用和分子机制。研究方法我们首先分析了公开数据库骨肿瘤患者中MARK2与化疗耐药和临床预后的关系。接下来,蛋白质印迹实验(Western blot)分析了 MARK2在骨肉瘤细胞系和正常成骨细胞系中的表达情况。然后在体内和体外实验中研究了 MARK2在骨肉瘤顺铂耐药中的作用。使用CCK-8分析、蛋白质印迹实验、免疫荧光实验、qRT-PCR、细胞凋亡和挽救实验来研究MARK2过表达和沉默后对顺铂耐药、P-gp表达、细胞凋亡和PI3K/AKT/NF-κB信号通路的影响。研究结果1.GEO数据库分析表明,MARK2高表达的骨肉瘤患者总生存率较低,对化疗反应较差。Spearman秩相关分析发现骨肉瘤患者MARK2和P-gp mRNA表达之间呈正相关的关系。与正常成骨细胞相比,MARK2在骨肉瘤细胞中表达显着上调。小干扰siRNA敲低了 MG-63和MNNG/HOS细胞系的MARK2水平后,P-gp表达水平随着下降。抑制P-gp可以降低骨肉瘤细胞顺铂耐药。这些结果说明MARK2的高表达与骨肉瘤的预后不良有关,可能与化学耐药呈正相关。2.在体外和体内实验中,过表达和敲低MARK2分别促进和抑制骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。过表达MARK2增加了骨肉瘤细胞系对顺铂的IC5。,同时抑制了裸鼠异种移植骨肉瘤中顺铂诱导的肿瘤体积减少率。敲低MARK2,降低了骨肉瘤细胞系对顺铂的IC50,同时增加了异种移植骨肉瘤肿瘤中顺铂诱导的肿瘤体积减少率。3.过表达MARK2促进骨肉瘤细胞P-gp的表达,抑制骨肉瘤细胞的凋亡率,并且促进 PI3K/AKT/NF-κB 信号通路中 p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65 和p-IκB-α的蛋白水平升高。敲低MARK2,抑制骨肉瘤细胞P-gp的表达,促进骨肉瘤细胞的凋亡,并且抑制PI3K/AKT/NF-κB信号通路中p-PI3K p85,p-AKT,p-NF-κB/p65 和 p-IκB-α 的蛋白水平。4.挽救实验证明,在过表达MARK2并用LY294002处理的骨肉瘤细胞中,顺铂IC50值部分下调,同时凋亡细胞比例部分升高,P-gp,p-AKT,p-NF-κB/p65和BCL-2的表达受到抑制,而BAX和cleaved caspase 3的表达水平则升高。MARK2的表达不受影响。这表明PI3K抑制剂一定程度上挽救了 MARK2过表达对顺铂耐药性的作用,进一步明确了 MARK2通过激活PI3K/AKT/NF-κB信号通路来调节P-gp表达和细胞凋亡,从而促进骨肉瘤细胞的顺铂耐药。结论MARK2的高表达与骨肉瘤的不良预后和化疗耐药有关。MARK2可以通过PI3K/AKT/NF-κB信号通路调节P-gp表达和细胞凋亡,从而增强骨肉瘤细胞的顺铂耐药,提示MARK2可能是骨肉瘤新的治疗靶点和预测化疗耐药的生物标志物。