家养野猪源猪圆环病毒2型安徽株的分离鉴定及其特性研究

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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2,PCV2)引起的临床症状主要为猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎-肾病综合征(PDNS)、猪增生性坏死性肺炎(PNP)、猪先天性脑震颤(CT)、猪的流产与繁殖障碍等。PCV2及其相关的猪病已在全世界范围内发生和流行,造成的危害相当严重。目前国内许多地方都在进行野猪资源的开发利用。为了了解安徽地区家养野猪是否存在PCV2感染,以及其在分子遗传特性和生物学特性是否存在差异。本研究对家养野猪病料进行PCV2分离与鉴定,全基因组测序以及各阅读框序列分析,与小鼠致病性实验。从而为了解家养野猪源PCV2安徽分离株的分子遗传特性和生物学特性,为猪圆环病毒病的研究提供依据。1.应用PK15细胞进行PCV2的分离与增殖,根据PCR、IFA、电镜技术进行PCV2分离株的鉴定。获得一株来自安徽家养野猪源PCV2分离株,命名为YZ0901。首次证明了安徽省家养野猪中也存在PCV2的感染。2.对YZ0901株与5株PCV2安徽分离株进行全基因组克隆和序列分析。YZ0901株基因全长1767bp组成,属于PCV2-1C基因簇,存在同源重组,与42株国内外参考毒株全基因组序列之间同源性为94.2-99.5%,ORF1和ORF2核苷酸序列同源性为96.7-100%和89.6-89.3%。YZ0901株ORF1相对保守,但ORF2差异较大,主要散在于ORF2两个主要免疫反应区内。YZ0901株基因型与安徽地区PCV2流行毒株相关。3.根据ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以重组质粒为标准品做标准曲线,建立了PCV2的TaqMan荧光定量PCR检测方法。TaqMan荧光定量建立的标准曲线循环阈值(Ct值)重复性较好,灵敏度约为6×101拷贝/μL,对猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟兔化弱毒无交叉反应。在临床样本检测中,该方法检测快速,灵敏度高。表明本方法快速、敏感、特异性强,具有较高的重复性,为PCV2的临床检测及组织亲嗜性、细胞培养特性等研究提供技术支持。4. YZ0901株与3株家猪源毒株进行小鼠攻毒实验,对其抗体、细胞因子和各组织中病毒粒子数量进行检测,并观察病理变化。YZ0901株的IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-10的浓度处于较低的水平,抗体波动大,引起脾小体增多和肾小球肿大、细胞增多的程度较大,且病毒粒子数的最高值(5.35×104拷贝/μL、5.995×104拷贝/μL)比其它各组大。表明YZ0901株感染小鼠,先产生细胞免疫抑制,后产生体液免疫抑制,并对脾脏、肾脏的亲嗜性较强。同属于PCV2b-1C基因簇的YZ0901株与XC0801株的免疫应答能力比PCV2b-1A(DY0801株)、PCV2b-1B(BH0801株)的低,对组织的亲嗜性则强于PCV2b-1A基因簇而弱于PCV2b-1B基因簇。
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