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RNA沉默是一种依赖核酸序列特异性的抗病毒防御机制,而针对寄主的这种防御机制,许多病毒演化出RNA沉默抑制子以克服这种防御反应,两者在互作过程中存在动态的协同进化现象,同时也受到一些环境因素的影响。PVX是马铃薯X病毒属的典型成员,易造成马铃薯病毒性退化。它所编码的25kD蛋白(p25)是一种运动蛋白,近些年许多研究发现这种蛋白不但决定了病害的发生程度,同时还与PVX的运动、长距离扩散及系统症状产生有关,p25可能负责介导病毒在植物体中的传播,这一过程通过运动蛋白和植物细胞的一些亚细胞结构的相互作用来完成。同时研究发现p25还是一种沉默抑制子。本研究的主要内容是:以野生型烟草为材料,转PVX p25基因,获得稳定表达p25的转基因植株,再与高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY~N CP)的转基因烟草进行常规杂交育种,播种后从子代中筛选含p25和CP基因的双转基因植株,通过抗病性分析和分子杂交,探讨烟草中稳定表达的p25对RNA沉默介导抗病性的影响;并通过透射电镜观察研究稳定表达的p25对转基因烟草叶片的胞间连丝孔径的影响。结果如下:1.本研究利用实验室已构建的含PVX p25基因的克隆载体pUC19,XbaI和SacI双酶切获得p25基因,将其连接到植物表达载体pBI121上,农杆菌介导法转化野生型烟草获得转基因植株。Western blot检测表明,转基因植株成功表达出p25蛋白。2.透射电镜检测表明,稳定表达p25的转基因植株叶片胞间连丝孔径较野生型增大3-6倍。这说明烟草中稳定表达的p25与PVX产生的p25有类似的作用,也能够作用于胞间连丝,增加胞间连丝的体积排阻极限,有利于病毒在细胞间运动。3.利用PVY~N CP基因介导的高抗转基因烟草为父本,稳定表达p25的转基因烟草去雄后与之进行常规杂交,从子代中筛选获得了含p25和CP基因的双转基因植株。4.对双转基因植株进行PVY~N接种进行抗病性检测,接种后第7天表现为系统感病,出现典型退绿斑症状。采用ELISA定期对PVY~N接种的双转基因植株进行抗性检测,在接种植株中检测出高滴度的PVY~N。这表明,PVX p25、PVY~N CP的双转基因植株中,稳定表达的p25导致了转基因植株的抗病性丧失。5. Northern杂交表明,双转基因植株中PVY~N CP RNA表达水平明显高于发生RNA沉默的父本植株。因此认为,PVX p25、PVY~N CP的双转基因植株中,稳定表达的p25抑制了PVY~N CP基因介导的RNA沉默,且转基因植株抗病性的丧失与p25对RNA沉默的抑制作用有关。