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目的： SDF-1通过与其表面受体CXCR4特异性结合来发挥作用，其在正常脑中含量很低。最初关于SDF-1的研究主要是在造血方面，现有的研究多集中在其对中枢神经系统的发育和损伤的修复作用以及它在肿瘤中对肿瘤细胞增殖、侵袭的影响，而鲜有文章研究其对凋亡的影响。在SDF-1对局部损伤组织的炎性因子影响研究中，一些研究表明其有抗炎作用而又有研究表明其具有促进炎症作用，在这方面存在很大的争议。有关SDF-1在颅脑损伤中的作用的报道表明损伤发生后SDF-1能诱导脑组织中血管的生成，起到修复的作用。 针对以上现状，本研究首次从凋亡蛋白Caspase-3、PARP以及凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bax途径探讨SDF-1在大鼠颅脑损伤后对细胞凋亡的影响，并辅以TUNEL法加以验证。通过检测ERK和NF-κB通路的活化情况明确SDF-1在颅脑损伤中到底是起到促进炎症还是抑制炎症的作用。以期为深入地探讨SDF-1对颅脑损伤的修复作用机制，为颅脑损伤的治疗提供有力的实验基础。 材料与方法： 一、基质细胞衍生因子-1(SDF-1)对大鼠颅脑损伤的影响 1、雄性SD大鼠共100只，随机分为一下五组:1）假手术组(sham)，2)颅脑损伤组(TBI)，3)颅脑损伤组+SDF-1组(TBI+SDF-1)，4)颅脑损伤+SDF-1抗体组(TBI+antibody)5)颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)。SDF-1所用剂量为4μg溶于4μl生理盐水中。SDF-1抗体所用剂量为4μg溶于4μl生理盐水中。大鼠造模采用Marmarous等人的方法，用40g击锤从30cm高处沿套管呈自由落体冲击于致伤垫，造成顶叶局部陛脑挫裂伤。造模成功30分后，给与SDF-1或SDF-1抗体。颅脑损伤24小时后处死各组大鼠，取出脑组织，根据后续实验目的不同采取不同方式收集样本。对于脑水肿的检测，大鼠处死后迅速取出脑组织，置于冰上备用。对于血脑屏障完整性检测，在大鼠损伤后23h注射2％伊文思蓝，一小时后灌注生理盐水去除血管内的伊文思蓝染料。对于其他检测，大叔灌注0.9％肝素的预冷生理盐水250ml后，处死大鼠，液氮速冻后，置于-80度冰箱备用。 2、伊文思蓝溢出(evans blue extravasation)法检测各组大鼠大脑皮层组织中，血脑屏障完整性. 3、甲苯酚紫(Cresyl Violet)染色法检测各组大鼠大脑皮层组织中神经元存活情况，并统计单个视野中存活的神经元数目。 二、SDF-1α对大鼠颅脑损伤后细胞增殖、凋亡的影响 1、免疫组化检测各组大鼠大脑皮层组织细胞核抗原(PCNA)的表达情况。 2、TUNEL法检测各组大鼠大脑皮层组织细胞凋亡情况。 3、Western blot检测各组大鼠大脑皮层组织中cleaved-Caspase-3、cleaved-PARP、Bcl-2和Bax的表达。 三、SDF-1α对大鼠颅脑损伤后炎性因子，NO及胞内相关信号途径分子的影响 1、实时定量PCR检测各组大鼠大脑皮层组织中TNF-α，IL-6和IL-1β等炎性因子的表达水平。 2、Griess反应法检测各组大鼠大脑皮层组织中NO的含量。 3、定时定量PCR和Western blot检测各组大鼠大脑皮层组织中iNOS的表达水平。 4、Western blot检测各组大鼠大脑皮层组织中AKT、p-AKT、p65 NF-Kb、p-p65NF-kB的表达水平。 实验结果： 结果一: 1、大鼠遭受自由落体打击后:大鼠肢体抽搐，并呼吸抑制（约10-15 s），部分大鼠出现前肢屈曲，后肢强直，证明大鼠颅脑损伤模型建模成功。 2、与假手术组对比:模型组与注射SDF-1α抗体组和注射生理盐水组EB溢出量明显增加，SDF-1α抗体组比模型组脑含水量与EB溢出量略高，模型组与注射生理盐水组相当。与模型组相比，SDF-1α组脑含水量与EB溢出量明显降低。 3、甲苯酚紫(Cresyl Violet)染色法检测各组大鼠大脑皮层组织中神经元存活结果表明:在sham组中，大脑皮层组织中神经元胞体相对较大，胞质浓密，含有1到2个较大的核。而TBI损伤组中，损伤神经元胞体出现萎缩，细胞核浓缩，胞质深染，并可见空腔囊泡。TBI+vehicle组与TBI组表现出相似结果。与TBI组相比，加入SDF-1α后，可见神经元细胞胞体萎缩程度有显著缓解，少见分细胞核浓缩，大部分细胞胞质浓密，细胞核清晰。而加入antibody组，神经元细胞萎缩现象加重，胞质深染，细胞核不清晰，出现浓缩。 结果二: 1、检测各组大鼠大脑皮层组织中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况结果显示:在sham组中，PCNA表达呈现阴性或弱表达，损伤后，TBI组PCNA表达呈现明显增强趋势，可见神经元细胞及胶质细胞呈现阳性表达。而在TBI+SDF-1α组中，大脑皮质区神经元及神经胶质细胞的PCNA表达增强，在加入antibody后表达下调，TBI+vehicle组PCNA达与TBI组相似。 2、TUNEL法检测各组大鼠大脑皮层组织细胞凋亡情况TUNEL结果显示，在sham组中，大脑皮层区神经元细胞无明显凋亡现象，神经元胞体正常，无固缩及破碎现象，细胞染色淡。而在TBI处理组及TBI+vehicle组中皮层神经元细胞出现明显固缩，凋亡现象明显，细胞染色显著增强。相比TBI组，TBI+SDF-1α组皮质区细胞凋亡现象减弱，而在加入antibody后，细胞凋亡趋势有所增强。提示SDF-1α可能有抑制细胞凋亡的作用。 3、WB检测SDF-1α对大鼠颅脑损伤后细胞增殖、凋亡的影响cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显高于假手术组(sham)，并且有显著差异，说明大鼠颅脑损伤后发生细胞凋亡。颅脑损伤后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax表达比模型组降低，且有差异，但仍高于假手术组，说明SDF-1α有一定的治疗作用。颅脑损伤+ SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显升高，且有显著性差异，说明颅脑损伤后再加入SDF-1α抗体，细胞凋亡更明显，损伤更严重。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。Bcl-2在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显低于假手术组（sham），并且有显著差异 颅脑损伤后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，Bcl-2表达比模型组升高，且有差异，但仍低于假手术组。颅脑损伤+ SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显降低，且有显著性差异。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。 结果三: 1、试剂盒法检测SDF-1α对大鼠颅脑损伤后炎性因子、NO及胞内相关信号途径分子的影响IL-6、TNF-α、IL-1β在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显高于假手术组（sham），并且有显著差异，说明大鼠颅脑损伤后发生炎性反应。颅脑损伤后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，IL-6、TNF-α、IL-1β表达比模型组降低，且有差异，但仍高于假手术组，说明SDF-1α有一定的治疗作用。颅脑损伤+SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显升高，且有显著性差异，说明颅脑损伤后再加入SDF-1α抗体，细胞炎性反应更明显，损伤更严重。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。 2、NO在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显高于假手术组(sham)，并且有显著差异。颅脑损伤后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，NO表达比模型组降低，且有差异，但仍高于假手术组。颅脑损伤+ SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显升高，且有显著性差异。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。 3、iNOS、p-ERK、p-p65 NF-κB在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显高于假手术组(sham)，并且有显著差异，颅脑损伤后加入SDF-1α(TBI+SDF-1α)，iNOS、p-ERK、p-p65 NF-κB表达比模型组降低，且有差异，但仍高于假手术组。颅脑损伤+ SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显升高，且有显著性差异。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。 4、p-AKT在颅脑损伤模型组(TBI)中表达明显高于假手术组（sham），并且有显著差异，颅脑损伤后加入SDF-1α（TBI+SDF-1α），p-AKT表达比模型组更高，且有差异。颅脑损伤+ SDF-1α抗体组(TBI+antibody)与模型组(TBI)组比较，明显降低，且有显著性差异。颅脑损伤+生理盐水组(TBI+vehicle)与模型组(TBI)比较，无显著性差异。ERK、p65 NF-κB、AKT各组间表达比较，均无差异。 结论： 1、 SDF-1α组与对照组及抗体组相比，EB溢出量明显降低。表明SDF-1α保护血脑屏障完整性的作用，同时有抑制损伤神经元胞体出现萎缩的作用，从而减轻脑损伤的程度。 2、通过对各组间(PCNA)，cleaved-caspase-3、cleaved-PARP、Bax，Bcl-2的不同表达情况的比较表明:SDF-1α有促进TBI后的细胞增殖和抑制细胞凋亡的作用。 3、试剂盒法检测SDF-1α对大鼠颅脑损伤后炎性因子、NO及胞内相关信号途径分子的影响，说明大鼠颅脑损伤后发生炎性反应。SDF-1α对TBI有一定的治疗作用。