一、目的与意义颈椎病泛指颈段脊柱病变后所表现的临床症状和体征。目前国际上较一致的看法是指颈椎间盘退行性变,及其继发性椎间关节退行性变所致脊髓、神经、血管损坏而表现的相应症状和体征。颈椎病的常见症状有颈痛、头晕、四肢麻木无力,严重的可以合并大小便障碍。颈椎病是中老年人的常见病、多发病之一。2010年福州市调查显示中青年伏案工作者中颈椎病患者占19.22%,颈椎病亚健康状态者占28.86%。长时间的伏案工作及使用电脑、驾车、高枕、睡软床等诸多因素,使人长时间保持单一姿势,肌肉韧带疲劳,从而加速了颈、腰椎疾病的发生。同时,饮食结构的改变及体重增加,也会加剧疾病的发生。因此对颈椎病的治疗任重而道远。颈椎病至今无理想的治疗方法。理疗、消炎止痛、颈托支持是现代治疗颈椎病的常用措施,外科治疗则以脊椎融合术为主；此外,同种异体髓核组织移植的动物试验、人工椎间盘置换技术也在探索之中。非甾体激素治疗颈椎病疗效不确切,胃肠反应重；手术治疗风险大、经济负担重,患者较难接受,并且存在复发的可能。传统中医药治疗本病显示出独特的优势,中医药治疗颈椎病历史久远,疗效确切,为颈椎病的治疗作出了不可磨灭的贡献,特别是近年来中医药在治疗颈椎病方面获得了长足的发展,多种复方具有较好的抗颈椎病作用,且疗效稳定、价格便宜。中医药治疗颈椎病的作用机理研究,局限在微循环、血流动力学、氧自由基、炎症介质、免疫等领域,而有关通过运用中医药抑制颈椎间盘退变阻断颈椎病发生、发展的研究却很少。通过研究中药复方对颈椎病的作用,初步探讨中药复方治疗颈椎病的机制。椎间盘退变的机制较为复杂,目前研究认为椎间盘退变主要表现在细胞和细胞外基质成分的变化,而后者是椎间盘力学特性丧失的直接原因,正常情况下,椎间盘细胞外基质(ECM)处于合成代谢与分解代谢的平衡之中,这一平衡的破坏造成髓核水分及其固有弹性的丧失,导致椎间盘生物力学功能的减退,从而出现椎间盘退变。基质金属蛋白酶-3 (MMP-3),又称基质溶解酶-1,它在细胞外基质的降解中起关键的作用。它不仅能降解蛋白多糖和糖蛋白,还能裂解多种类型的胶原。此外,它还能激活其他非活性的基质金属蛋白酶(MMPs)而对软骨基质的降解发挥间接作用。转化生长因子-β1 (TGF-β1)是一种细胞生长调节因子,具有细胞趋化、软骨诱导、调节软骨中ECM合成等作用。TGF-β1具有多重生物学效应,是调控骨髓间充质干细胞(MSCs)增殖和向成软骨方向定向分化的主要生长因子之一,可抑制多种炎症介质的生物学活性,使同种异体细胞移植更为安全；可促进蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成。利用动物模型复制疾病是研究和探讨疾病病因病机的重要方法,骨骼和韧带维持关节稳定和平衡的作用称为静力平衡,肌肉维持该作用称为动力平衡,颈部正常的生理运动及其稳定性总是在静力平衡的基础上,依靠肌肉的作用来随时调整以达到动力平衡完成的。通过破坏大鼠颈椎动静力平衡系统就可以制成动静力平衡失调的大鼠颈椎病模型。综上所述,椎间盘的退变和椎间盘细胞外基质(ECM)的降解密切相关,而TGF-β1可以促进ECM的合成；MMP-3可以促进ECM的降解。基于前期的实验及临床研究,选用颈椎舒颗粒治疗大鼠颈椎间盘退变,通过比较各组间椎间盘中TGF-β1和MMP-3含量的差异,来初步探讨颈椎舒颗粒对颈椎间盘退变的作用途径。二、方法与内容1、大鼠颈椎间盘退变模型造模选择3个月龄SPF级SD大鼠,雄性140只,体重(300±20)g左右,适应性喂养一周后,将其分成手术组大鼠124只,假手术中16只。将所有大鼠用10%水合氯醛按3.5ml·kg-1体重腹腔内注射,麻醉成功后,颈后部剪毛,碘伏消毒,无菌操作。取颈背部正中纵向切口,长约2-2.5cm,切开皮肤后,充分游离各层肌肉,横向切断深群颈夹肌和头、颈、寰最长肌,完全切除颈髂肋肌与头半棘肌,然后再依次切断C2-C7棘上和棘间韧带,彻底止血后缝合皮肤。16只假手术的正常大鼠,在颈后部正中作一长约2-2.5cm的切口,止血后缝合。术后3天给予青霉素肌注,8万μ/天。缝线自行脱落,术后放至笼中,任其自由活动。12周后造模完成。2、动物分组12周后成模,假手术中16只全部造模成功。手术组在手术中及术后共死亡14只,随机抽取80只分成5组分别为：颈椎舒颗粒低剂量组(C组)、中剂量组(D组)、高剂量组(E组),颈复康颗粒组(F组),模型组(B组),每组16只。16只假手术组(A组)无死亡。共6大组。每大组内再分为给药4周组8只和给药8周组8只。3、灌胃治疗：按照实验动物学药剂换算方法,计算各组药物的大鼠灌胃量：大鼠的每日药量(中剂量g.kg-1.d-1)=标准体重人(60kg)的每日剂量×0.018×5。颈椎舒颗粒的低、中、高剂量分别设置为0.7 g·kg-1.d-1、1.4 g·kg-1·d-1、2.8 g.kg-1.d-1。颈复康颗粒的剂量定位0.7 g·kg-1·d-1。模型组和假手术组给予等容积生理盐水。4、标本取材及制备：分别在用药4周及用药8周后用急性失血法处死大鼠,立即取大鼠整段颈椎,范围自枕骨基底部到第二胸椎,每只大鼠的C5-6椎间盘及相邻椎体分别放在10%福尔马林溶液固定,进行形态学检测,观察其退变情况。各大鼠的C6-7在4倍手术显微镜下沿上、下软骨终板与椎体的交界面切下椎间盘,用生理盐水洗去血污,椎间盘组织各20mg加入0.5ml磷酸盐缓冲液(PH7.4),组织放入-80℃低温冰箱保存备用,用于ELISA法检测。5、切片观察：用于光镜观察的标本在10%中性甲醛固定,15% EDTA脱钙2周,正中矢状位切开颈椎,用酒精梯度脱水,二甲苯透明,石蜡块包埋,切片机切片,苏木素一伊红染色,显微镜下观察,据髓核、纤维环、终板及椎体退变情况。按照Miyamoto等的分级标准对椎间盘评分。1级：正常椎间盘,纤维环与髓核排列规则,软骨终板分为生长软骨和关节软骨层,潮标清晰。2级：纤维环板层结构消失,软骨终板增生。3级：髓核皱缩或消失。4级：纤维环有裂隙。5级：椎间盘突出或骨赘形成。6、ELISA法检测TGF-β1和MMP-3含量步骤严格按各个试剂盒说明书进行。7、统计学方法各组颈椎间盘退变程度比较采用秩和检验,数据统计分析均采用SPSS16.0软件进行统计分析,P<0.05为有统计学意义。各组颈椎间盘中TGF-β1和MMP-3含量的比较均析因设计资料的方差分析,数据应用SPSS16.0统计软件包进行,各组大鼠治疗4周和8周的变化比较采用两独立样本t检验(Two Independent-Samples t Test)进行统计分析,不同用药组间比较采用单因素方差分析(One—way ANOVA)进行统计分析,方差齐时多重比较采用LSD-t法检验；方差不齐时,用近似方差分析的Welch法,多重比较采用DunnettT3法检验。三、结果1、各组颈椎间盘退变程度切除鼠颈后部浅、中层肌肉等,破坏鼠颈部动静力平衡,可以造成颈椎间盘退变,模型组(B组)、假手术组(A组)、颈椎舒低剂量组(C组)、颈椎舒中剂量组(D组)、颈椎舒高剂量组(E组)、颈复康组(F组)的椎间盘退变程度差异有显著意义(P<0.05)。模型组(B组)退变显著,各治疗组(C、D、E、F组)次之。2、各组大鼠椎间盘的ELISA结果显示2.1各组颈椎间盘的MMP-3的浓度：不同组别大鼠颈椎间盘中MMP-3含量相比较有显著差异(F=87.517,P=0.000),结合SNK法多重比较结果,假手术组(A组)、颈椎舒低剂量组(C组)、中剂量组(D组)、高剂量组(E组),颈复康组(F组)中颈椎间盘的MMP-3的浓度均显著低于模型组(B组)。D、E、F组中MMP-3的浓度均显著低于C组。D组和F组无显著差异。两个不同用药时间之间有显著差异(F=6.581,P=0.012),用药8周组中MMP-3的浓度均显著高于用药4周组。2.2各组颈椎间盘的TGF-β1的浓度：不同组别相比较有显著差异(F=87.990,P=0.000),结合SNK法多重比较结果,假手术组(A组)、颈椎舒低剂量组(C组)、中剂量组(D组)、高剂量组(E组),颈复康组(F组)中颈椎间盘的TGF-β1浓度均显著高于模型组(B组)。D、E、F组中TGF-β1的浓度均显著高于C组。两个不同用药时间之间无显著差异(F=0.174,P=0.678),但用药8周的均数有高于用药4周的趋势。四、结论1、颈椎舒颗粒、颈复康颗粒都具有改善颈椎间盘退变的作用。2、通过破坏动物颈椎动静力平衡系统可以成功研制出和人类颈椎病发病因素(长期低头)相似的颈椎病动物模型。3、颈椎舒颗粒缓解颈椎间盘退变的机制可能通过以下两因素来影响细胞外基质而体现：(1)减少MMP-3在椎间盘内的合成；(2)促进TGF-β1在椎间盘内的合成。4、颈椎舒颗粒随着用药疗程的延长,治疗颈椎间盘退变的效果可能越显著。