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弥漫大 B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是一种常见的侵袭性肿瘤,其病程进展迅速,预后差。由于基因特征的不同,DLBCL患者的临床表现和预后具有很大的差异。近年来,DLBCL的治疗方法正在从传统方法转变为化学疗法与分子靶向药物联合治疗。因此,积极探讨基于DLBCL新型分子靶点和信号通路进行预后分层和靶向治疗的策略具有重要意义。血管抑素结合蛋白（Angiomotin,AMOT）最初于2001年被鉴定为与血管生成抑素结合并调节血管生成或内皮细胞迁移的介质,其蛋白结构具有高度保守的卷曲螺旋结构域和C端的PDZ结合模体。AMOT在哺乳动物胎盘的较大血管以及毛细血管的内皮细胞中表达,定位于细胞紧密连接以及肌动蛋白细胞骨架处,具有调控细胞骨架重排、管状结构形成、细胞极性等功能。近年来研究发现,AMOT与多种实体肿瘤的发生发展密不可分,但其具体机制尚有争议。AMOT可能是多形性未分化肉瘤、非小细胞肺癌等肿瘤的抑癌因子,但在乳腺癌、鼻窦癌等肿瘤中,AMOT过表达并促进肿瘤细胞增殖或侵袭。AMOT在上述大部分肿瘤中参与调控Hippo信号通路,是YAP1的上游正向或负向调控分子,也有通过Wnt/catenin、ERK1/2、PI3K-AKT或VEGFR-2通路发挥抑癌或者促癌作用的报道。然而,AMOT在DLBCL中的表达水平及临床意义尚未见报道。本研究旨在分析AMOT在DLBCL中的表达和临床意义,深入研究AMOT对DLBCL细胞增殖、细胞周期等特性的影响,初步探讨AMOT在DLBCL发病机制中的生物学作用。第一部分:AMOT在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达及临床意义目的:DLBCL是一种高度恶性的造血系统肿瘤,约有30-40%的患者对一线免疫化学治疗无效,以及出现复发或难治性过程。积极探讨基于DLBCL新型分子靶点和信号通路进行预后判断和靶标治疗的策略具有重要意义。最新研究发现,越来越多的实体肿瘤中可以检测到AMOT的异常表达及作用机制,但其在造血系统恶性肿瘤中的表达水平及临床意义尚不明确。第一部分研究的目的是检测AMOT在DLBCL中的表达情况,初步探讨AMOT对于DLBCL诊断和预后的临床意义。材料与方法:1.病例选择及样本收集;2.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）;3.外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PMBCs）分离;4.细胞培养;5.实时定量聚合酶链式反应（Real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR）;6.蛋白提取和免疫印迹（Western Blot）;7.统计学分析。结果:1.我们通过IHC技术检测了 AMOT蛋白在52例新诊断的DLBCL患者及25例反应性淋巴样增生（reactive lymphoidhyperplasia,RLH）患者的病理组织中的表达水平。与对照组RLH相比,AMOT在DLBCL患者组织样本中的表达显著下降。2.通过qRT-PCR和Western Blot技术检测发现,与对照组健康志愿者PBMCs相比,AMOT mRNA和蛋白表达量在人DLBCL细胞株LY1、LY8和Val中显著下降（p<0.001）。3.收集上述DLBCL患者的临床资料进行统计学分析,发现AMOT蛋白的表达水平与患者的血清乳酸脱氢酶（P=0.023）、IPI评分（P=0.017）和NCCN-IPI评分（P=0.005）呈负相关,与患者的年龄（P=0.219）、性别（P=0.991）、Ann Arbor分期（P=0.12）、B症状（P=0.245）、疾病亚型（P=0.1）和有无结外侵犯（P=0.458）无关。我们对其中28例DLBCL患者进行Kaplan-Meier分析,发现AMOT表达阳性患者的生存期显著长于AMOT表达阴性患者（p=0.03 5）。结论:本研究表明,AMOT在DLBCL病理组织及细胞株中表达下降,AMOT低表达与DLBCL患者的不良预后相关。AMOT可能成为DLBCL病理诊断及预后分层的潜在标记物。第二部分:AMOT参与弥漫大B细胞淋巴瘤发病机制的研究目的:探索分子靶标是了解DLBCL发病机理以及寻找新的分层和治疗靶点的重要途径。既往研究表明,AMOT可通过调控Hippo/YAP1、Wnt/catenin等多种信号通路促进或者抑制肿瘤的生长。因此,AMOT与肿瘤的关系仍值得进一步探讨。第二部分研究的目的是探索AMOT对于DLBCL细胞增殖、细胞周期等特性的影响,探讨AMOT在DLBCL发病机制中的生物学作用。材料与方法:1.细胞培养;2.慢病毒载体介导AMOT基因过表达;3.实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）;4.蛋白提取和免疫印迹（Western Blot）;5.Cell Counting Kit-8（CCK-8）;6.Propidium iodide（PI）染色法;7.Annexin V/7-aminoactinomycin D（7-AAD）双染法;8.统计学分析。结果:1.我们使用AMOT过表达慢病毒（LV-AMOT）和空载体慢病毒（LV-Con）分别稳定转染人DLBCL细胞株LY1和LY8,CCK-8法检测发现,LV-AMOT组DLBCL细胞的增殖活性显著降低。2.CCK-8法检测发现,端锚聚合酶抑制剂XAV939和JW55可以浓度和时间依赖性的方式抑制LY1和LY8细胞的增殖。通过Western blot技术检测发现,XAV939和JW55分别作用于LY1和LY8细胞后,细胞内AMOT蛋白水平升高。3.与对照组相比,LV-AMOT组DLBCL细胞出现G1期阻滞,而细胞凋亡率无明显变化。通过Western blot技术检测发现,LV-AMOT组DLBCL细胞的DNA 损伤反应通路关键蛋白 ATM（Ser 1981）,ATR（Ser428）,Chkl（Ser345）,Chk2（Thr68）和H2A.X（Ser139）的磷酸化水平下降,而相关基因的mRNA表达水平无明显变化。4.在细胞毒类药物多柔比星作用后,与对照组相比,LV-AMOT组细胞的增殖活性下降,出现细胞周期G1期阻滞及凋亡率升高,提示AMOT可增加DLBCL细胞对多柔比星的敏感性。通过Western blot技术检测发现,经多柔比星作用后,LV-AMOT组DLBCL细胞的ATM（Ser1981）,ATR（Ser428）,Chk1（Ser345）,Chk2（Thr68）和 H2A.X（Ser139）磷酸化水平显著低于对照组。结论:上述结果提示,AMOT对DLBCL细胞的增殖具有抑制作用,可诱导DLBCL出现G1期阻滞,增加对多柔比星的敏感性。从作用机制上讲,AMOT可抑制DLBCL细胞的DNA损伤反应通路中关键蛋白的活性,从而减弱DLBCL细胞对于DNA损伤的修复能力。AMOT有望成为DLBCL患者靶向药物联合化疗的新靶标。