缺血性脑卒中是神经系统常见病、高发病,也是导致成人致残及死亡的主要病因。因为其病理生理机制复杂,目前针对急性缺血性脑卒中仍缺乏有效的治疗方法,是现阶段我们面临的严峻的医疗及社会难题。在脑梗死病灶的中心缺血区周围是缺血半暗带,在缺血半暗带由于尚存在侧支循环,故神经元仍有存活的机会。因此尽早恢复缺血半暗带的血流才能改善神经功能、进而降低脑梗死的致死率及致残率。但是大量研究证实,即使在缺血半暗带的血流被迅速恢复,仍可能对局部脑组织造成损伤,被称为缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion injury,IRI)。造成IRI的病理机制非常复杂,已开展的研究发现可能有细胞内钙超载、自由基生成、氧化应激反应、兴奋性氨基酸毒性、炎症反应、细胞凋亡等多种机制参与其中。我们前期研究证明炎症反应及氧化应激反应机制与IRI的关系密切,并且越来越受到研究者的关注。炎症反应是人体固有免疫的组成部分,当病原体入侵时人体会做出快速防御反应以清除病原体、保护机体免受伤害。由固有免疫细胞如单核细胞、巨噬细胞产生的炎症调节因子,如Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs),可以识别病原体表面的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs),进而启动炎症反应。TLRs家族作为炎症调节因子参与人体的适应性免疫及固有免疫,广泛表达于多种细胞,如上皮细胞、内皮细胞、间皮细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、T细胞、NK细胞,巨噬细胞等。在TLRs家族中,TLR4是最早被人类发现的TLR。已有文献报道TLR4、核因子-κB(Nuclear factor-kappa B,NF-κB)和髓样分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MyD88)的活化参与了脑缺血损伤的病理生理过程。MyD88-TLR4复合物可以激活炎症因子、并募集NF-κB,而NF-κB参与调节大量与免疫反应相关的蛋白的表达,如丝裂原活化蛋白酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs),进而进一步参与到IRI炎症反应机制中。TLR4/NF-κB通路在IRI中发挥作用的相关机制早已成为研究热点。氧化应激机制在IRI中发挥重要作用,已成为缺血性脑卒中潜在的临床干预方向。其中Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)-antioxidant response element(ARE)信号通路作为细胞抵御氧化应激的主要机制之一,是目前针对IRI发病机制的研究热点。Nrf2蛋白在细胞质内是与Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like ECH–associated protein 1,Keap1)结合、处于抑制状态而无法发生核转位发挥其转录活性。缺血诱发氧化应激反应后,被激活的Nrf2蛋白从Keap1蛋白上解离并发生核转位,在细胞核内与ARE结合到一起,促进多种抗氧化酶如血红素氧合酶-1(HO-1),NAD(P)H醌氧化还原酶(NQO-1),谷胱甘肽-S-转移酶(GST),超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase,SOD1)等的表达,发挥其抗氧化应激作用。众所周知,维持中枢神经系统内环境稳定的关键是血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)。而脑微血管内皮细胞(Brain microvascular endothelial cell,BMEC)及其之间的紧密连接(tight junction,TJ)是BBB重要的组成部分。BBB通透性与TJ结构、功能密切相关。紧密连接蛋白ZO-1和occludin是构成内皮细胞TJ的重要组成部分、对BBB通透性具有重要的调节作用。而基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)是降解细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)的关键蛋白水解酶,其中MMP-9的表达与血管通透性密切相关。已有研究发现IRI发生时MMP-9表达上调、ZO-1与occludin丢失增加,导致血脑屏障完整性遭到破坏、通透性增加,进而加重脑水肿、导致神经细胞死亡。乌司他丁(Ulinastatin,UTI)是一种从健康青年男性新鲜尿液中提取的糖蛋白,对多种蛋白酶具有抑制作用。研究发现,乌司他丁可以对一些炎症或免疫相关的疾病发挥治疗作用,如溃疡性结肠炎、急性肾小球肾炎等。但是否对由炎症机制及氧化应激反应等多种机制参与的IR后的神经损伤具有保护作用及具体作用机制尚有待深入研究。我们的研究通过制作CD1小鼠短暂性大脑中动脉闭塞模型(Transient middle cerebral artery occlusion,tMCAO),观察乌司他丁对CD1小鼠缺血再灌注(Ischemia reperfusion,I/R)后的神经行为学、脑水肿程度、脑梗死体积、血脑屏障完整性的干预作用,并进一步采用免疫组织化学方法和分子生物学的方法测定TLR4、NF-κB、p-p38MAPK、Nrf2、NQO-1、HO-1、MMP-9、ZO-1、occludin的表达,探讨其可能的保护机制,从而为IR后神经保护治疗提供新的实验依据。第一部分CD1小鼠脑缺血/再灌注模型的建立目的:成功建立CD1小鼠脑缺血/再灌注模型,进而为开展针对脑缺血/再灌注的试验研究奠定基础。方法:成年健康雄性CD1小鼠60只,体重25~30g(周龄6~8周),分为手术组(I/R)和假手术组(Sham)。手术组采用改良Longa线栓法制备CD1小鼠右侧大脑中动脉短暂缺血模型(tMCAO),在右侧大脑中动脉闭塞60min后,拔出线栓而使局部血流恢复,从而建立小鼠脑缺血/再灌注模型。假手术组除不插入线栓外其余操作同手术组。参照Longa的5级4分法,进行CD1小鼠脑I/R后神经行为学评分;用2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死体积。采取干湿重法检测两组脑组织的含水量。结果:与假手术组对比,手术组CD1小鼠神经行为学评分明显升高(P<0.001)。再灌注24h后,用TTC染色观察脑梗死体积:假手术组无梗死病灶形成,手术组局部形成大面积梗死病灶;手术组与假手术组对比存在显著差异(P<0.001)。干湿重法测得脑组织含水量:手术组梗死同侧脑组织含水量较假手术组明显升高,两组对比存在显著差异(P<0.001)。结论:改良Longa线栓法是有效的、易于掌握的制备CD1小鼠脑缺血/再灌注模型的方法,此方法制作的I/R模型可以用于脑IRI实验研究。第二部分TLR4/NF-κB信号通路在乌司他丁对小鼠脑缺血/再灌注损伤保护作用中的地位目的:通过观察TLR4/NF-κB信号通路参与的炎症调节在乌司他丁对小鼠局灶脑缺血再灌注损伤中的作用,进一步探讨乌司他丁对小鼠IRI的神经保护机制。方法:选用成年雄性CD1小鼠,体重25~30g(周龄6~8周)为研究对象,分为手术组(I/R)、假手术组(Sham)、低剂量乌司他丁干预组(UTI-L 1500IU/100g)、高剂量乌司他丁干预组(UTI-H 3000IU/100g)。改良Longa线栓法制备CD1小鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型术后,手术组及假手术组:腹腔注射等量生理盐水,UTI-L组:腹腔注射乌司他丁1500IU/100g,UTI-H组:腹腔注射乌司他丁3000IU/100g。各组小鼠于术后24 h进行神经行为学评分,后断头取脑,用干湿重法测定脑组织含水量,用TTC染色测定脑梗死体积,用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR法测定TLR-4、p-p38MAPK、NF-κB的表达。结果:与手术组(I/R)对比,术后24小时UTI-L组和UTI-H组神经行为学评分显著改善(P<0.001)、脑梗死体积明显减小(P<0.001)、脑水肿明显减轻(P<0.001)。免疫组化结果显示:与手术组相比,UTI-L组和UTI-H组TLR-4、p-p38MAPK、NF-κB阳性细胞数明显减少,差异具有统计学意义(P<0.001)。Western blot结果显示:I/R组在术后24hTLR-4、p-p38MAPK、NF-κB蛋白表达较sham组升高,差异具有统计学意义(P<0.001),UTI-L组和UTI-H组与I/R组相比,能够明显降低TLR-4、NF-κB、p-p38MAPK的蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.001)。而TLR-4、NF-κB、p-p38MAPK在mRNA表达水平与其在蛋白质表达水平一致。结论:乌司他丁可以改善I/R小鼠神经行为学评分,减小脑梗死体积,减轻脑水肿,对局灶性缺血/再灌注脑损伤小鼠发挥神经保护作用;其保护机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路进而发挥抑制炎症反应作用密切相关。第三部分Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)-antioxidant response element(ARE)信号通路在乌司他丁对小鼠脑缺血/再灌注损伤保护作用中的地位目的:通过观察Nrf2-ARE信号通路参与的抗氧化应激机制在乌司他丁对小鼠局灶脑缺血再灌注损伤中的作用,进一步探讨乌司他丁对小鼠IRI的神经保护机制。方法:选用成年雄性CD1小鼠,体重25~30g(周龄6~8周)为研究对象,分为手术组(I/R)、假手术组(Sham)、低剂量乌司他丁干预组(UTI-L1500IU/100g)、高剂量乌司他丁干预组(UTI-H 3000IU/100g)。改良Longa线栓法制备CD1小鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型术后,手术组及假手术组:腹腔注射等量生理盐水,UTI-L组:腹腔注射乌司他丁1500IU/100g,UTI-H组:腹腔注射乌司他丁3000IU/100g。各组小鼠于术后24 h断头取脑,用干湿重法测定脑组织含水量,用2,3,5-三苯基四唑氮红(triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色测定脑梗死体积,用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR法测定Nrf2、NQO-1、HO-1的表达。结果:与手术组(I/R)对比,术后24小时UTI-L组和UTI-H组神经行为学评分显著改善(P<0.001)、脑梗死体积明显减小(P<0.001)、脑水肿明显减轻(P<0.001)。免疫组化结果显示:Nrf2、NQO-1、HO-1阳性细胞数在I/R组表达较Sham组增加,UTI-L组和UTI-H组Nrf2、NQO-1、HO-1阳性细胞数增加更为显著,与I/R组相比,结果具有统计学意义(P<0.001);Western blot结果显示,UTI-L组和UTI-H组可上调Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白水平表达,与I/R组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。而Nrf2、NQO-1、HO-1在mRNA表达水平与其在蛋白质表达水平一致。结论:乌司他丁可以改善I/R小鼠神经行为学评分,减小脑梗死体积,减轻脑水肿,对局灶性缺血/再灌注脑损伤小鼠发挥神经保护作用;其保护机制与激活Nrf2-ARE信号通路发挥抗氧化应激作用密切相关。第四部分乌司他丁对血脑屏障的影响在其对小鼠脑缺血/再灌注损伤保护作用中的地位目的:通过观察乌司他丁对小鼠脑I/R后血脑屏障通透性的影响,进一步探讨乌司他丁对小鼠脑IRI的神经保护机制。方法:选用成年雄性CD1小鼠,体重大约为25~30g(周龄6~8周)为研究对象,分为手术组(I/R)、假手术组(Sham)、低剂量乌司他丁干预组(UTI-L 1500IU/100g)、高剂量乌司他丁干预组(UTI-H 3000IU/100g)。改良Longa线栓法制备CD1小鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注模型术后,手术组及假手术组:腹腔注射等量生理盐水,UTI-L组:腹腔注射乌司他丁1500IU/100g,UTI-H组:腹腔注射乌司他丁3000IU/100g。各组小鼠于术后24h断头取脑,用干湿重法测定脑组织含水量,用TTC染色测定脑梗死体积,用Western blot、RT-PCR法测定MMP-9、ZO-1、occludin的表达。通过观察伊文思蓝(Evans blue,EB)渗出情况评估血脑屏障的完整性。结果:伊文思蓝染色结果显示:术后24h,与I/R组相比,UTI-L组和UTI-H组能够明显减少脑组织中Evans blue渗出,差异具有统计学意义(P<0.001)。且与I/R组相比,UTI-L组和UTI-H组MMP-9表达水平显著降低(P<0.001),而ZO-1、occludin表达水平显著升高(P<0.05)。结论:乌司他丁可以减小I/R小鼠脑梗死体积、减轻脑水肿、改善神经行为学评分,其保护作用机制可能与抑制I/R后MMP-9表达、减少ZO-1、occludin蛋白的丢失,进而降低BBB通透性相关。结论:1.乌司他丁可以改善I/R小鼠神经行为学评分,减小脑梗死体积,减轻脑水肿,降低BBB通透性。2.乌司他丁对小鼠脑IRI的保护机制可能与抑制缺血后TLR4/NF-κB信号通路发挥抑制炎症反应机制,以及激活Nrf2-ARE通路抑制缺血后氧化应激反应密切相关。并通过抑制MMP-9的表达、减少ZO-1及occludin丢失来改善BBB的通透性,进而发挥脑保护作用。