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2006年,Takahashi和Yamanaka将四个诱导因子oct4、sox2、klf4和c-myc导入小鼠胚胎成纤维细胞,进而获得了类似于胚胎干细胞的多能干细胞,称之为“诱导多潜能干细胞”(iPS细胞)。
由于iPS细胞在临床治疗中有着巨大的潜在应用价值,因此,有很多研究小组对iPS细胞进行了各方面的研究,如iPS细胞的安全性、iPS细胞的诱导效率、iPS细胞在模式动物或人类疾病中的临床应用及不同物种iPS细胞的诱导等。
本试验以山羊为材料分离山羊耳尖成纤维细胞,并通过慢病毒将源自人类的oct4、sox2、Hf4和c-myc四个诱导因子导入山羊耳尖成纤维细胞,在不同饲养层以及不同化学物质处理的条件下,尝试诱导得到山羊iPS细胞,初步建立山羊iPS细胞诱导的方法。结果如下:
1.将慢病毒包装所需的包装载体pMD2.G、psPAX2及含有人oct4、sox2、klf4和c-myc四个诱导因子的慢病毒载体回收、转化、扩大培养后提取质粒,电泳检测及双酶切鉴定均可见预期大小的条带。
2.采用胰蛋白酶消化法分离昆明小鼠胚胎成纤维细胞,采用组织块贴壁法分离山羊耳尖成纤维细胞,均成功分离到所需细胞,并能良好的培养、冻存及复苏。丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞、山羊耳尖成纤维细胞、猪胎儿成纤维细胞和山羊胎儿成纤维细胞,制备饲养层。
3.培养293T细胞,通过脂质体2000共转染慢病毒载体及相应包装载体,进行慢病毒包装,收集慢病毒上清,提取慢病毒上清RNA并反转录得到cDNA,采用定量PCR测定慢病毒滴度。计算得到慢病毒滴度:oct4为8.025x105/ml；sox2为3.056x106/ml；klf4为2.952×106/ml；c-myc为4.965×106/ml。
4.慢病毒感染山羊耳尖成纤维胞、猪胎儿成纤维细胞和山羊胎儿成纤维细胞,在不同饲养层、以及不同化学物质处理(维生素C、丙戊酸、维生素C加丙戊酸)条件下进行诱导培养。结果显示,只有山羊耳尖成纤维细胞饲养层条件下诱导得到iPS细胞,而不同化学物质处理对于iPS细胞的诱导没有起到明显效果。
5.对得到的iPS细胞进行碱性磷酸酶染色及SSEA-1、oct4免疫细胞化学染色,发现iPS细胞表现碱性磷酸酶活性且SSEA-1、oct4免疫细胞化学染色结果呈阳性。
6.提取iPS细胞RNA,RT-PCR检测几个外源因子及一些相关胚胎干细胞标记基因,发现iPS细胞表达全部四个外源因子及胚胎干细胞标记基因oct4和nanog,但不表达胚胎干细胞标记基因eras、daxl、gdf3。