微生物型视紫红质家族是一类由7个跨膜α-螺旋(helix A-G)组成的吸光色素膜蛋白。发色团视黄醒醛(retinal)通过与赖氨酸共价形成席夫碱(Schiff-base),从而与蛋白结合,用来吸收光子进行光能转换或细胞内的初始信号传导。在过去的十五年,变形菌视紫红质(proteorhodopsin,PR)在细菌、病毒、真菌和古菌里面都有发现,并且分布广泛,存在于海洋,淡水,海冰,高山甚至永久冻土中,成为了微生物型视紫红质超家族中最丰富的成员。尽管PR(主要存在于真细菌)与嗜盐古菌的视紫红质(bacteriorhodopsin,BR)的氨基酸序列有不到30%的同源性,但是它们却有一个相似的光驱动质子泵功能,都能利用光能将质子从细胞内转移到细胞膜外侧。前期研究表明PR蛋白的Asp97和Glu105是相对保守的,与BR中的Asp85和Asp96有相同的作用,分别是席夫碱的初级质子受体和质子供体。相反,PR的质子释放基团只有Arg94是保守的,另一对存在于BR中的谷氨酸却不存在(BR中Arg82,Glul94和Glu204),这就暗示PR蛋白质子传递的机制可能不同。然而,PR蛋白的结构信息很少,尤其是PR蛋白的晶体结构,因此许多机制并不清楚。HOT75BPR是一种从太平洋HOT站75米深海水中分离得到的蓝光型变形菌视紫红质(blue-light proteorhodopsin,BPR)基因。先前已经报道了此蛋白D97N突变体的结晶条件,由于晶体衍射分辨率的限制,未能解析其结构。本文在此结晶条件基础上,采用Ni2+亲和层析方法纯化大肠杆菌表达产物,运用气相扩散方法,成功优化了蛋白的结晶条件,获得了高质量的HOT75BPRD97N天然蛋白的晶体,同时又制备了HOT75BPR D97N硒代甲硫氨酸衍生蛋白晶体,运用Se-SAD的方法成功确定了HOT75BPRD97N蛋白的相位,首次解析了 BPR蛋白的晶体结构,晶体最高分辨率为2.7 A。HOT75BPR D97N蛋白晶体的空间群为P21212,每个PR单体分子由7个α-螺旋(helixA-G)构成,生色团视黄醛位于7个跨膜螺旋之间。HOT75BPR与其他视紫红质的结构有较大的差异。BPR中helix B-C之间的loop很短,只有四个残基Gly87-Pro90形成了 β转角,缺少了其他微生物视紫红质结构中都存在的β折叠片层,使得质子释放基团附近形成一个空腔,直达细胞外表面。螺旋E在Gly196处发生螺旋扭曲,helixG的残基Asn231发生扭结,形成π-凸起。这些构象的不同可能影响了质子的转运。依据此结构我们发现PR的质子转移机制与BR的不同。PR中螺旋D-E loop上的一个新的保守的Glu142参与了质子的释放,通过三个酪氨酸残基Tyr95、Tyr208和Tyr224的强氢键作用力固定,与Arg94 一起将质子释放到胞外。在质子由席夫碱转移至质子受体过程中也缺失了 BR中的关键水分子W402。这些特点也与我们解析的从水下12米深海水中分离得到的另一种BPR基因编码的蛋白(Med12BPR)的结构类似。研究已经证实BR和PR蛋白还有一个显著差异,即PR中席夫碱反离子Asp97的pKa值(7-8)远远高于古菌BR蛋白Asp85的pKa(小于3),然而导致这种现象的具体机制还不清楚。HOT75BPR蛋白晶体结构显示是C5五聚体,五条肽链相互作用,紧密的结合在一起。同源蛋白比较分析,五聚体中的分子间相互作用只有一部分是保守的,接口区域涉及到的跨膜螺旋明显不同,尤其是N末端和螺旋A中的亲水作用力和盐键作用网络。HOT75BPR D97N蛋白晶体结构还显示,PR蛋白中保守的组氨酸与邻近单体中Trp34形成了氢键,与分子内的席夫碱反离子Asp97的突变体Asn97之间不形成氢键,但距离很近。这个分子间氢键Trp34-His75是一种新型的分子间作用力,在其他视紫红质中未见报道。这个新型的氢键作用通过Med12BPR的晶体结构和生物信息学序列比对证明在BPR蛋白中可能是保守的。此外N末端Asp22的羧基基团也与相邻单体的Thr91,Va192和Phe93形成氢键。前期我们发现Asp22Val突变体蛋白的Asp97的pKa值明显降低,为了明确Asp97的pKa值的调控机制,我们解析了HOT75BPRD22V蛋白的晶体结构。与D97N的结构比对发现,这种现象可能与BPR蛋白的寡聚体状态有关。Asp22突变为Val时,第22位的分子间氢键作用消失,His75与Trp34和Asp97的氢键作用也发生变化。因此,我们提出了 Asp97位pKa值的调控机制,Trp34和Asp22的单体间相互作用可以通过保守性组氨酸His75调节席夫碱反离子Asp97的pKa值。PRs是地球上最丰富的以视黄醛为辅基的吸光蛋白。PR蛋白的两个亚家族(green light-absorbing proteorhodopsin 和 blue light-absorbing proteorhodopsin,即绿光型 GPR和蓝光型BPR)体现了高水平的环境适应性,因为其颜色被调整到可用光的最佳波长。两大亚科的吸光色彩(GPR,λmax= 525 nm;BPR,λmax= 490nm)可以通过105位氨基酸的Gln/Leu点突变相互转化。本文我们成功测定了HOT75BPR野生型和第105位氨基酸残基的19种突变体的吸光特性,吸收峰显示所有类型的蛋白均存在全反式视黄醛,其中三种突变体(Q105K,Q105W和Q105Y)明显还存在另一种视黄醛异构体。光学特性比较发现,所有突变体蛋白的光谱最大吸收值都发生了红移并且氨基酸侧链的体积与吸光特性一定程度上呈现正相关性。通过对HOT75BPR野生型和第105位不同突变体蛋白结晶条件的优化,我们成功获得了四种晶体结构,分别为 wt(λmax= 496 nm),105C(λmax= 521 nm),105M(λmax=533 nm)和105F(λmax= 543 nm),涵盖了蓝光,绿光和最大红移的光谱色彩吸收值。我们揭示了 105位氨基酸光谱色彩调谐作用背后的结构基础,可能有三个主要因素:(ⅰ)视黄醛结构的扭曲,(ⅱ)席夫碱和反离子之间的距离,(ⅲ)视黄醛多烯链和周围带电、极性、芳香族氨基酸的静电作用和空间位阻效应。