慢性痛严重影响人类身心健康。长期的疼痛可导致包括焦虑、抑郁在内的多种精神障碍。有报道指出慢性痛患者患抑郁症的机率为正常人的三倍,且抑郁症发病率随着疼痛症状的增多而逐渐升高。多种动物模型实验结果显示长期的慢性痛可诱导产生抑郁样行为。然而,慢性痛及抑郁的中枢机制尚不十分明确。尤其值得注意的是,并不是所有慢性痛患者或慢性痛模型动物都会表现出抑郁样行为。因此,对慢性痛如何导致抑郁的中枢通路和神经机制的进一步研究,可能为临床上预防慢性痛诱发抑郁的发生,以及阻断慢性痛和抑郁的交互恶化提供新的策略和靶点。近年来,外侧缰核(lateral habenula,LHb)及中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)因其同时在疼痛和抑郁中发挥作用而引起广泛关注。LHb属于上丘脑的一部分,主要向中脑单胺能核团,VTA及中缝背核(dorsal raphe nucleus,DR)等发出投射,参与调节脑内多巴胺(dopamine,DA)及5-羟色胺能系统的功能活动。临床上功能磁共振(functional magnetic resonance imaging,f MRI)的研究及相关动物研究均显示LHb在疼痛刺激和抑郁存在的情况下可被激活。有报道证明,LHb激活后,大鼠强迫游泳实验中的不动时间及快感缺失行为均增加,而LHb损毁后抑郁样行为则得以改善。以上结果均提示LHb作为边缘前脑和脑干之间的一个重要枢纽,不仅与奖赏-厌恶、成瘾、内分泌、动机活动等有关,而且也是疼痛调控和抑郁产生的一个重要的汇聚站。另一方面,慢性痛和抑郁的发生发展也和中脑DA系统的异常息息相关。诸多基础研究和临床研究均显示,长期慢性痛状态可能会引起中脑DA系统紊乱;影像学研究也表明慢性痛患者纹状体中的突触前DA活性均降低。同时,慢性痛模型动物体内DA水平也有下降。这种慢性痛引起的机体的低DA状态会导致动机性行为的减少,从而进一步诱发情绪低落、兴趣缺乏和快感缺失等抑郁症状。到目前为止,有关慢性痛诱导抑郁症产生的机制尚不明确;且慢性痛状态下LHb-VTA传导通路投射神经元功能活动的异常是否会参与抑郁的发生也不十分清楚。因此,为了搞清以上问题,本实验主要从以下几个方面展开研究。第一部分:LHb向双侧VTA内DA能和GABA能神经元均有直接投射研究目的:探讨LHb神经元向VTA内DA能神经元和GABA能神经元的投射关系实验方法:将顺行示踪腺相关病毒(adeno-associated viruses,AAV)AAV-Ca MKIIa-mcherry定位注入LHb,或将逆行示踪剂荧光金(Flurogold,FG)定位注入VTA,然后通过观察LHb内逆标神经元的方法,来验证LHb向VTA的投射关系;利用改装过的狂犬病毒和两种Cre转基因动物(DAT-Cre:标记DA能神经元和GAD2-Cre:标记GABA能神经元),进行细胞特异性的单级跨突触逆行示踪,以观察是否有LHb神经元直接投射至VTA内DA能或GABA能神经元,并在动物处死前制作福尔马林急性痛模型,结合Fos免疫荧光染色,观察LHb向VTA内DA能或GABA能神经元发出投射的神经元是否可直接被外周伤害性信息所活化。结果:(1)VTA可接受双侧LHb的纤维投射。将顺标病毒AAV-Ca MKIIa-mcherry定位注入LHb后,可观察到双侧VTA内有大量的呈红色荧光的投射纤维;而将FG定位注入VTA后,也可在双侧LHb内观察到大量的FG逆标神经元,且以同侧投射为主。(2)VTA内DA能和GABA能神经元均接受LHb神经元发出的纤维投射。将两种重组的AAV:AAV-Ef1α-DIO-EGFAP-TVA和AAV-Ef1α-DIO-RVG定位注入DAT-Cre动物的VTA区,并在VTA内联合注入RV-ENVA-ΔG-ds Red病毒后,可观察到RV-ENVA-ΔG-ds Red在感染VTA内DA能神经元后可逆行跨突触标记双侧LHb神经元;同样在GAD2-Cre动物的实验也观察到自VTA内GABA能神经元逆行跨突触标记的LHb神经元。(3)在逆行跨突触示踪的基础上结合福尔马林急性痛模型和Fos染色,观察到投射向VTA内DA能和GABA能神经元的LHb神经元中均有部分呈现Fos免疫阳性。结论:LHb向VTA有大量的纤维投射,这些纤维不仅可直接投射至VTA内DA能神经元,也可直接投射至VTA内GABA能神经元,且这两条神经通路均可被外周疼痛刺激所激活。第二部分:慢性痛诱导抑郁后动物LHb和VTA内神经元的电生理特性的改变目的:构建慢性痛动物模型,并检测慢性痛诱发抑郁后动物LHb和VTA内神经元的电生理学特性改变。方法:根据文献构建小鼠坐骨神经套管模型(sciatic nerve cuffing model),简称为cuffing模型,并用von Frey丝检测该模型小鼠的痛行为,用悬尾实验、溅水实验(splash test,ST)、新奇抑制摄食实验(novelty suppressed feeding test,NSF)和强迫游泳实验分别检测小鼠的抑郁样行为。根据小鼠抑郁样行为的表现可将其分成三组:对照组(Con组);单纯疼痛组(Pain组);疼痛伴抑郁组(Dep组)。利用Western blot方法检测LHb内与抑郁发生密切相关的蛋白β-Ca MKII和VTA内DA合成的限速酶TH的表达情况;利用四甲基罗达明(TMR)进行逆行示踪,结合电生理学方法,检测该模型小鼠LHb-VTA投射神经元在慢性痛和慢性痛诱发抑郁后的自发放电频率和幅值的改变,以及慢性痛和慢性痛诱发抑郁后小鼠VTA内DA能神经元和GABA能神经元的电生理特性的改变。结果:(1)小鼠坐骨神经cuffing模型术后1 d即表现出缩足阈值明显下降,且可保持长达10周以上,部分小鼠在术后8周时可表现出明显的抑郁样行为。与Con组相比,Dep组小鼠悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间明显延长(P<0.001),ST实验中小鼠的理毛行为潜伏期缩短(P<0.001),以及NSF中小鼠第一次取食的潜伏期延长(P<0.001)。(2)长期慢性痛后,Pain组和Dep组小鼠LHb内与抑郁密切相关的蛋白β-Ca MKII的表达明显上调,而VTA内TH的表达则显著下降。(3)在VTA内注射逆行示踪剂TMR后,记录LHb内TMR逆标神经元的电生理特性,可观察到慢性痛后cuffing模型小鼠LHb-VTA投射神经元的自发放电的频率和幅值均显著增加,且慢性痛诱发抑郁的Dep组s EPSC的频率和幅值均较Pain组明显增高。(4)全细胞膜片钳记录VTA神经元,可观察到长期慢性痛对Pain组和Dep组小鼠VTA内DA能神经元的自发放电的频率和幅值均无显著影响,而VTA内GABA能神经元的放电频率和幅值则明显增加。对VTA内DA能神经元的IPSC记录显示:与Con组比较,cuffing模型小鼠(包括Pain组和Dep组)的IPSC频率和幅值均有明显增加。结论:长期的慢性痛可以诱发部分小鼠出现抑郁样行为,同时导致慢性痛模型小鼠LHb内β-Ca MKII表达增加。慢性痛发生后LHb-VTA投射神经元和VTA内GABA能神经元的自发放电活动增加,使VTA内DA能神经元受到抑制性传入增多,导致VTA内DA能神经元的活动受到抑制,TH的表达下调。其中慢性痛诱发的LHb神经元的过度活化以及由此引发的对VTA内DA能神经元功能的降低可能与慢性痛诱发抑郁密切相关。第三部分:特异性调控LHb-VTA投射通路对慢性痛及慢性痛诱发抑郁样行为的影响目的:利用药理遗传学和光遗传学方法探讨特异性调控LHb-VTA通路对慢性痛动物的痛行为和抑郁样行为的影响。方法:将RetroAAV2/2-CMV-bGlobin-Cre定位注入小鼠双侧VTA,同时将Cre依赖性表达的药理遗传学病毒AAV2/9-Syn-DIO-h M4Di-m Cherry或AAV2/9-Syn-DIO-h M3Dq-m Cherry定位注入双侧LHb,腹腔注射氧化氯氮平(clozapine N-oxide,CNO)后,检测特异性抑制或激活LHb-VTA投射神经元对小鼠痛行为和抑郁样行为的影响。将Cre酶依赖性表达的光遗传学病毒AAV2/9-Ef1a-DIO-Ch R2-m Cherry定位注入DAT-Cre或GAD2-Cre转基因动物的LHb内,VTA内植入光纤,给予光照特异性的激活或抑制VTA内的DA能神经元或GABA神经元,观察对小鼠痛行为和抑郁样行为的影响。结果:(1)给予CNO特异性抑制LHb-VTA投射神经元后,Con组小鼠缩足阈值无明显改变,但Pain组和Dep组小鼠缩足阈值明显升高,Dep组小鼠悬尾实验不动时间和NSF实验的取食潜伏期较给药前明显缩短,而splash test的理毛潜伏期则明显有所回升,小鼠的强迫游泳不动时间也明显缩短。(2)与(1)相反,给予CNO特异性激活LHb-VTA投射神经元后则使Con组、Pain组和Dep组动物的机械痛缩足阈值均有所下降,同时可诱使小鼠出现抑郁症状或加重抑郁小鼠的抑郁样表现。(3)利用光遗传学特异性激活VTA内DA能神经元可显著改善Pain组和Dep组小鼠的痛行为学表现,使其缩足阈值明显回升,同时伴有对抑郁样行为的改善作用;而特异性激活VTA内GABA能神经元,其作用正好相反,三组动物的缩足阈值均明显下降,并伴有抑郁样行为的加重。结论:LHb-VTA通路可参与对慢性痛模型小鼠的痛行为和抑郁样行为的调控,而其中VTA内GABA能神经元的活化可能发挥更关键的作用。第四部分:慢性痛促使的LHb-VTA投射通路可塑性改变是慢性痛诱发抑郁的关键目的:研究慢性痛后LHb-VTA投射通路是否发生了突触可塑性改变,以及其改变对小鼠慢性痛诱发抑郁的影响。方法:将光遗传学病毒定位注入LHb,对cuffing模型小鼠的痛行为和抑郁样行为学进行检测,之后结合全细胞膜片钳技术检测光诱发的兴奋性突触后电流双脉冲比值(paired-pulse ratio,PPR),以探索LHb投射至VTA的突触终末突触前释放是否发生了改变。另外,记录并计算光诱发的AMPAR/NMDAR比值(AMPAR/NMDA ratio)来反应LHb-VTA神经通路突触后AMPAR和NMDAR的相对变化。最后利用光诱发长时程增强(long term potentiation,LTP)的方式,改变慢性痛模型小鼠LHb-VTA通路的可塑性,观察对该小鼠抑郁样行为的影响。结果:(1)利用光遗传学方法特异性激活VTA内来自LHb的投射终末可降低慢性痛模型小鼠的机械性缩足阈值,加重其痛行为学表现,诱发小鼠出现抑郁样行为或加重其抑郁样行为学表现。(2)在VTA脑片上,蓝光刺激可在DA能神经元上直接诱发出AMPA受体依赖的兴奋性突触后电流,同时亦可在一定时间延长后诱发出抑制性突触后电流。(3)在全细胞膜片钳下对光诱发的兴奋性突触后电流的PPR进行检测,可观察到Pain组和Dep组VTA内DA能神经元的PPR均无明显改变,但VTA内GABA能神经元的PPR在慢性痛模型建立后明显降低。(4)在全细胞膜片钳下记录光诱发的AMPAR电流和NMDAR电流,并计算二者的比值,可观察到VTA内GABA能神经元在抑郁发生后其AMPAR/NMDAR比值明显较Con组和Pain组有所增加。(5)利用光刺激诱发LHb-VTA投射终末LTP后,可促使慢性痛模型小鼠理毛实验的潜伏期缩短(P<0.001),悬尾实验不动时间明显延长(P<0.01)。结论:LHb投射纤维与VTA内DA能神经元之间既有单突触连接,亦可通过局部GABA能神经元的中继后再间接投射至DA能神经元;而慢性痛状态尤其是诱导抑郁发生后LHb-VTA投射通路会发生突触可塑性改变,这种改变既有突触前机制的参与,亦有突触后机制的作用。在体利用光诱发LTP的方式也进一步证实,该通路可塑性改变可能是慢性痛诱发抑郁发生的关键。