【摘 要】
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植物内生菌是一种重要的生物资源,可以促进植物稳定高效生产,作为生物肥料使用,可减少过量施用化学肥料带来的一系列环境和健康问题。本论文从紫花苜蓿中分离得到一株内生放线菌MtRt-6,并探究其对植物的促生长作用,为进一步了解其促生长机制及其在农业中的开发利用提供理论依据。研究内容和结果如下:（1）内生放线菌的分离与鉴定:通过表面消毒和4种分离培养基（TWEY、YMA、MS、HV）的使用,从苜蓿根部分离
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植物内生菌是一种重要的生物资源,可以促进植物稳定高效生产,作为生物肥料使用,可减少过量施用化学肥料带来的一系列环境和健康问题。本论文从紫花苜蓿中分离得到一株内生放线菌MtRt-6,并探究其对植物的促生长作用,为进一步了解其促生长机制及其在农业中的开发利用提供理论依据。研究内容和结果如下:（1）内生放线菌的分离与鉴定:通过表面消毒和4种分离培养基（TWEY、YMA、MS、HV）的使用,从苜蓿根部分离出一株内生放线菌MtRt-6。结合生理生化特征、16S r RNA序列同源性分析和Non-Redundant Protein Database的注释,将其鉴定为拟无枝酸菌Amycolatopsis tolypomycina,属于稀有放线菌。（2）内生放线菌MtRt-6的生理生化特征分析:通过不同条件的培养实验,发现MtRt-6对培养基和碳源的种类、温度和p H的适应范围均较广。在检测培养基上培养,发现其能产生蛋白酶、几丁质酶、纤维素酶、酪氨酸酶、淀粉酶等水解酶,并且具有固氮、溶磷、解钾、产ACC酶等促进植物生长相关的特性。通过顶空-气相色谱质谱联用的方法对MtRt-6产生的挥发性物质进行鉴定,发现其成分为罗勒烯、2-甲基-2-龙脑烯和2-甲基异龙脑。（3）MtRt-6的全基因组测序及生物信息学分析:MtRt-6的全基因组大小为10,575,343 bp,G+C含量为71.63%,预测到有9,777个编码蛋白质的基因、7个r RNA操纵子、53个t RNA基因和29个s RNA基因。此外,通过对KEGG数据库和Swiss-Pro数据库注释结果的综合分析,MtRt-6的基因组中发现了19个编码与固氮、氨同化、硝酸和亚硝酸还原等氮代谢途径相关的酶的基因,包括isc U、glt BD、gln AE、nar UGHIK、gdh、acd S等基因。同时,预测分析发现MtRt-6基因组中35个次级代谢产物合成基因簇。（4）MtRt-6的促进宿主生长特性分析:将不同浓度(10~6,10~7,10~8孢子·m L-1)的MtRt-6孢子液分别以灌根和包埋的方式接种到苜蓿和水稻上,发现接种后的植株生物量较未接种植物均有显著提高,且这种作用具有剂量依赖性,对苜蓿和水稻促生长作用效果最好的MtRt-6孢子液浓度分别是10~6孢子·m L-1和10~7孢子·m L-1。实时荧光定量PCR的结果显示,接种了的苜蓿及水稻的MtRt-6管家基因atp D表达量显著上调,说明MtRt-6在苜蓿和水稻内均能稳定定殖。同时,苜蓿及水稻的氮同化关键基因GS表达量亦显著上调,表明MtRt-6可能通过调节宿主体内的氮代谢促进宿主植物的生长。总之,本研究分离到鉴定到一株苜蓿内生放线菌拟无枝酸菌Amycolatopsis tolypomycina MtRt-6,研究其各种特性表明该菌具有被开发为生物菌肥的潜力。
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