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第一部分目的肿瘤微环境在肿瘤的起源和发展中发挥重要作用。本研究旨在探索放化疗对食管鳞癌肿瘤微环境的影响,并评估肿瘤浸润淋巴细胞对患者的预后价值。方法该研究回顾性分析104例接受单纯手术或术前新辅助放化疗的食管鳞癌患者。HE染色切片评估肿瘤浸润淋巴细胞,免疫组化法检测肿瘤组织中Fox P3+T细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD56+NK细胞和PD-L1表达。结果1.与单纯手术组患者比较,术前新辅助放化疗患者肿瘤微环境中总TILs,CD8+TILs,CD4+TILs和NK TILs密度高(P<0.05),Foxp3+TILs浸润无明显差异(P>0.05),肿瘤细胞PD-L1表达明显增加(P<0.05)。2.TILs、CD8+TILs和CD4+TILs浸润程度与术后病理T分期和N分期相关(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤位置、软组织浸润等无明显相关性(P>0.05);Foxp3+TILs和CD56+NK TILs浸润程度与性别、年龄、分期、肿瘤位置、软组织浸润等均无明显相关性(P>0.05);PD-L1蛋白与术后病理T分期和N分期相关(P<0.05),而与性别、肿瘤位置和软组织浸润无明显相关性(P>0.05)。3.单因素分析显示,T分期,N分期,CD8+TILs,CD4+TILs和Fox P3+TILs与患者DFS相关,Cox多因素生存分析显示CD4+TILs和Fox P3+TILs是影响DFS的独立预后因素(P<0.05);单因素分析显示,T分期,N分期,CD8+和CD4+TILs与患者OS相关,Cox多因素生存分析显示T分期和CD8+TILs是患者OS的独立影响因素(P<0.05)。4.在48例术前新辅助放化疗患者中,与肿瘤无反应患者(TRG3-5)相比,25例放化疗后肿瘤组织有明显病理缓解反应(TRG1-2)的患者yp T分期较早(P<0.001),淋巴结反应明显(P=0.004),CD8+TILs浸润密度更高(P=0.027)。与无淋巴结降期的患者相比,27例新辅助放化疗后淋巴结降期(c N+-p N0)的患者yp N分期(P<0.001)较早,肿瘤组织中TILs浸润无明显差异(P>0.05)。结论1.食管鳞癌患者放化疗后肿瘤组织中TILs,CD8+TILs,CD4+和CD56+TILs浸润密度增加,PD-L1表达增加。2.肿瘤浸润TILs,CD8+TILs,CD4+TILs与术后病理T分期和N分期存在相关性,病变分期晚的患者肿瘤浸润淋巴细胞密度低。3.肿瘤浸润Foxp3+TILs,CD4+和CD8+T细胞是食管癌患者可靠的预后预测因素,这为食管癌放化疗联合免疫治疗的综合抗肿瘤治疗策略提供新的依据。4.新辅助放化疗后肿瘤组织反应与CD8+TILs浸润程度相关,CD8+TILs浸润高的患者,肿瘤放化疗反应明显。第二部分目的循环淋巴细胞参与机体抗肿瘤免疫应答,这种细胞类型具有放疗敏感性。本研究旨在测量放化疗诱导的淋巴细胞亚群的变化,并评估淋巴细胞亚群改变对食管鳞癌患者的预后价值。方法该研究入组64名接受根治性性放化疗或术前新辅助放化疗的食管鳞癌患者。在治疗前和放疗剂量达40Gy时收集外周血样品,并通过流式细胞术分析放化疗前、后外周血CD19+B细胞,CD3+T细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞和CD56+或CD16+NK细胞各淋巴细胞亚群的变化,进一步分析淋巴细胞亚群改变与和患者预后之间的关系。结果1.与治疗前比较,CRT后外周血CD19+B细胞比例减少(P<0.05),CD3+和CD8+T细胞比例增加(P<0.05),CD4+T细胞和NK细胞的比例未见明显变化(P>0.05)。2.放化疗后CD8+T细胞和CD4+T细胞变化与患者临床病理因素之间无明显相关(P>0.05);CD19+B细胞变化与年龄相关(P<0.05),而与性别、疾病分期、肿瘤位置等无明显相关性(P>0.05);CD56+NK细胞与患者体重变化和肿瘤部位相关(P<0.05),而与性别、年龄、疾病分期等无明显相关性(P>0.05)。3.单因素分析显示,TNM分期,肿瘤部位和CD4+T细胞变化与患者PFS相关,Cox多因素生存分析显示CD4+T细胞比值和TNM分期是影响PFS的独立预后因素(P=0.042,0.029);单因素分析显示,TNM分期,肿瘤部位和CD8+T细胞变化与患者OS相关,Cox多因素生存分析显示CD8+T细胞比值是患者OS的唯一独立影响因素(P=0.040)。进一步分析发现,放化疗后CD4+和CD8+T细胞比例均增加的患者PFS和OS均优于CD4+或CD8+比例仅有一项升高或均降低的患者(1年PFS率为63%vs 25%,1年OS率为80%vs 62%,P=0.005和0.025)。结论1.食管鳞癌患者放化疗后CD19+B细胞比例下降,而CD8+T细胞比例增加。2.CD4+和CD8+T细胞是食管癌患者可靠的预后预测因素,这为食管癌放化疗联合免疫治疗的综合抗肿瘤治疗策略提供新的依据。第三部分目的炎性细胞因子在肿瘤微环境中发挥重要作用,与肿瘤的发生和发展密切相关。本研究旨在分析食管鳞癌患者放化疗前、后血清细胞因子表皮生长因子(EGF)和尿激酶纤溶酶原激活物受体(u PAR)表达变化及其临床意义。方法该研究纳入了2015年至2017年期间接受根治性同步放化疗或术前新辅助放化疗的食管鳞癌患者。分别在治疗前和放疗剂量达40Gy时采集外周血标本。通过采用细胞因子抗体芯片检测8名食管癌患者放化疗前、后血清细胞因子的变化并进一步分析其与放化疗反应的关系,筛选出了7种差异表达的细胞因子。其中,EGF和u PAR放化疗后升高和患者不良预后相关。进一步在60例食管癌患者中评估EGF和u PAR的临床价值。结果1.通过含有120中肿瘤相关细胞因子的抗体芯片检测和比较4名放化疗敏感和4名放化疗抵抗的患者放化疗前、后血清细胞因子表达,筛选出了EGF,u PAR,MIP-1β,MIF,IL-8,PDGF-BB和BDNF 7种差异表达的细胞因子。其中,放化疗EGF和u PAR后升高和患者不良预后相关。2.单因素分析显示年龄,TNM分期和u PAR表达变化与患者PFS相关,Cox多因素生存分析显示年龄,TNM分期和u PAR表达变化仍然是影响PFS的独立预后因素(P<0.05);单因素分析显示肿瘤部位,TNM分期和CRT后EGF表达变化与患者OS相关,Cox多因素生存分析显示TNM分期和EGF表达变化是影响OS的独立预后因素(P<0.05)。当ESCC患者分为两组时,CRT后EGF和u PAR比值均高的患者与其他食管癌患者相比PFS和OS较差(1年PFS率为44.2%vs.61.4%,1年OS率为64.2%vs.83.4%,P=0.033,0.029)。3.相关性分析显示,治疗前血清EGF与u PAR表达水平呈正相关(r=0.4884,P=0.0001),治疗后血清中EGF和u PAR表达水平也呈正相关(r=0.3775,P=0.0038)。结论1.血清细胞因子u PAR和EGF是食管鳞癌患者可靠、有效的独立预测指标,这为放化疗联合分子靶向分子治疗的综合抗肿瘤治疗策略提供新的依据。2.食管癌患者放化疗前、后血清EGF和u PAR表达水平呈正相关,提示二者可能参与同一信号转导通路。第四部分目的PD-1/PD-L1途径在肿瘤免疫逃逸机制中发挥重要作用。有研究报道在非小细胞肺癌研究中,表皮生长因子受体(EGFR)突变状态和PD-L1表达相关。本研究旨在研究食管鳞癌细胞中PD-L1表达与EGFR信号通路和放疗的关系。方法流式细胞术和蛋白质印记法评估ESCC细胞中EGFR和PD-L1表达;在EGF刺激ESCC细胞后,检测在有或无EGFR抑制剂AG-1478时ESCC细胞的PD-L1表达;应用EGFR信号通路芯片分析潜在的信号通路;用不同剂量照射ESCC细胞,检测在有或无EGFR抑制剂AG-1478时ESCC细胞的PD-L1表达。结果1.不同EGFR表达的ESCC细胞系中,PD-L1的表达水平与EGFR基本一致。2.EGF刺激细胞后,kyse30细胞PD-L1升高最多,TE7,TE1,Eca109,和kyse140细胞PD-L1表达中等升高(P<0.05),kyse510 and Ca Es-17 cells食管癌细胞PD-L1的表达未见明显升高(P>0.05),EGFR特异性抑制剂AG-1478抑制EGFR信号通路后,kyse30 and TE-1食管癌细胞中PD-L1的表达下降。3.应用EGFR信号通路芯片在野生型EGFR表达kyse30和TE1细胞以及EGFR突变型TE7细胞中分析发现,EGFR信号通路活化可上调PD-L1,可能与EGFR-PI3K-AKT、EGFR-Ras-Raf-Erk和EGFR-PLC-γ信号通路相关。4.放疗诱导ESCC细胞PD-L1表达以剂量和EGFR依赖方式增加,EGFR特异性抑制剂AG-1478抑制EGFR通路后PD-L1表达下降。结论1.EGF通过激活EGFR信号通路诱导食管癌细胞PD-L1的表达,这可能与EGFR-PI3K-AKT、EGFR-Ras-Raf-Erk和EGFR-PLC-γ信号通路相关。2.放疗可通过诱导EGFR信号通路活化上调PD-L1,这为食管癌的放化疗联合靶向治疗和免疫治疗的综合治疗策略提供实验依据。