前言局部麻醉药是临床广泛应用的麻醉药物,使用局部麻醉药进行神经阻滞对于手术中或手术后疼痛的控制具有重要作用。与全身麻醉和静脉使用阿片类镇痛药物相比,神经阻滞麻醉对患者机体内环境干扰小,并且能更好的缓解疼痛,有利于患者身体功能早期恢复,因而更加受到麻醉医师的欢迎。然而,使用局部麻醉药物进行神经阻滞可能造成神经毒性甚至导致术后神经并发症。因此,大部分患者应用局部麻醉药只是短期应用。尽管如此,应用局部麻醉药进行神经阻滞仍然可能造成永久性神经损伤,在有些病例甚至会造成永久性腰骶部神经病变和马尾神经综合征。大约1/3的患者经历过短暂的神经症状,持续性腰骶部神经病变的发生率大约为1/200到1/3000,另外在局部麻醉后诱发了马尾神经综合征的患者大概为1/1000到1/10000。临床常用局部麻醉药布比卡因是一种钠通道阻滞剂,一直被广泛的应用于局部神经浸润麻醉、硬膜外麻醉和鞘内麻醉。然而,布比卡因具有神经毒性作用能够造成神经损伤。因此,深入研究局部麻醉药物的神经损伤机制,研发降低神经损伤风险的新措施是非常必要的。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,以异源三聚体的形式存在,它含有一个起催化作用的α亚基和两个起调节作用的p和γ亚基,当调节亚基β和γ亚基与α亚基结合后,此酶的活性大大提高。大量证据表明,AMPK在调节细胞能量状态以及控制细胞代谢水平中都发挥着重要的作用。最近有研究表明AMPK与神经元的生存和死亡密切相关。Kim研究团队报道了AMPK对布比卡因处理过的施万细胞的细胞保护作用。由于局部麻醉药物的神经毒性作用是神经损伤的主要原因之一,因此AMPK信号分子可能参与了局部麻醉药物的神经损伤机制。高车前素(Hispidulin)是一种天然的黄酮类化合物,可以从天山雪莲等中草药中提取获得。以往体内体外研究提示高车前素具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌以及抗炎和抗诱变等很多的性能。另有研究证明,高车前素可以作为正性变构分子作用于苯二氮卓类受体。最近一项研究表明高车前素可以抑制大鼠脑皮质神经元谷氨酸的释放。高车前素还被证实可以通过血脑屏障并具有抗癫痫的作用。总之,这些研究提示高车前素可以作为神经元细胞的调节剂。此外,高车前素可以通过AMPK信号通路抑制人多形性胶质母细胞瘤细胞增殖。因此,高车前素可能通过AMPK通路减弱局部麻醉药物导致的神经毒性。为证明该假设,本研究拟应用高车前素作用于布比卡因处理的小鼠神经母细胞瘤N2a细胞,采用检测细胞增殖活力、细胞凋亡和线粒体膜电位变化等方法来分析高车前素和布比卡因对N2a细胞活力的影响。在此基础上,再应用AMPK信号通路特异性抑制剂研究高车前素和布比卡因导致细胞活力改变的具体机制。研究方法1细胞培养小鼠神经细胞瘤N2a细胞从日本东京医学研究所获得。N2a细胞培养在含有10%胎牛血清和100μg/ml青霉素与100μg/ml链霉素的MEM培养基中。将细胞放在37℃恒温湿润并含有5%CO2的细胞培养箱中培养,细胞融合达到85%时进行传代培养。在制作实验所需细胞悬液前将N2a细胞消化处理并培养过夜。2MTT法测定细胞活力采用MTT法测定N2a细胞活力,简言之,N2a细胞在含有或者不含有高车前素的不同浓度布比卡因中分别进行处理12小时、24小时和36小时。将细胞进一步以0.5mg/ml MTT试剂在37℃条件下孵育4小时,然后加入DMSO溶解甲臜结晶,并在酶标仪上测量其在570nm处的吸光度数值。3细胞凋亡检测采用FITC标记的Annexin V细胞凋亡检测试剂盒,对凋亡的N2a细胞进行测定。简言之,N2a细胞用冰冷的磷酸盐缓冲液进行漂洗,并重悬于结合缓冲液中,细胞浓度为1×106个细胞/ml。在暗室中将细胞用Annexin V-FITC和Propidium (PI)染色,用流式细胞仪进行分析。Annexin V-FITC阳性和PI-阴性细胞被认为是凋亡细胞。4线粒体膜电位的测定采用JC-1染料评估N2a细胞处理前后线粒体膜电位的变化。JC-1染料是线粒体特异的亲脂性阳离子荧光染料,正常条件下JC-1聚集在线粒体内并发射红色荧光。然而,当细胞凋亡过程中线粒体膜电位被打乱,JC-1染料会发出绿色荧光。因此,红色与绿色的JC-1荧光的比值被用作评估线粒体膜电位变化的标记。N2a细胞用布比卡因处理12小时后,加入100μl的JC-1溶液并将细胞与JC-1继续孵育1小时,然后用PBS洗涤两次,再在流式细胞仪上进行分析。5免疫蛋白质印迹检测制备用于免疫印迹分析的N2a细胞。取50μg溶胞产物在12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,并转印。将膜孵育特定的一抗：AMPK, p-AMPK, GSK3β, p-GSK3β和Caspase-3,然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗进行孵育。免疫反应条带采用增强的化学发光试剂显色。结果通过密度计扫描进行定量。6统计学处理实验数据分析采用SPSS13.0统计学软件进行,计量资料采用均数±标准差(x±s)来表示；两组数据之间的统计学差异通过单因素方差分析(ANOVA)进行评价。多重比较采用Tukey’s检验。P<0.05被定为差异有统计学意义。研究结果1布比卡因使N2a细胞的存活率降低用布比卡因在不同浓度不同时间处理N2a细胞。结果表明,布比卡因降低N2a细胞的存活率,其作用呈时间剂量依赖性。细胞凋亡率随布比卡因的浓度增加而增加。本实验结果提示用400μM布比卡因作用12小时不会明显降低细胞存活率或诱导细胞凋亡。然而,N2a细胞与1200μM布比卡因共孵育36小时可以杀死全部细胞。在本研究中,我们选择800μM的布比卡因浓度作为后续实验浓度,来探讨高车前素是否对布比卡因造成的N2a细胞损伤有保护作用。2高车前素逆转布比卡因造成的N2a细胞的损伤作用本研究检测了高车前素对布比卡因造成的细胞损伤的影响。40μM或更高浓度(如60μM、80μM)的高车前素可以逆转布比卡因造成的细胞存活率的降低。由于不同浓度的高车前素对N2a细胞的保护作用未见明显差异,我们选择40μM作为后续实验浓度。本实验中使用布比卡因处理N2a细胞12小时、24小时和36小时可以降低细胞存活率分别为42.4%,52.4%和74.9%(P<0.05)。虽然高车前素单独处理对N2a细胞的存活率无明显影响,但高车前素可以明显逆转布比卡因诱导的N2a细胞的损伤。与对照组相比,在布比卡因作用N2a细胞12小时、24小时和36小时后,高车前素可以明显提高N2a细胞的存活率,分别提高26%、38.5%和47.5%(P<0.05)。3高车前素逆转布比卡因对N2a细胞的凋亡作用我们应用流式细胞仪来检测高车前素是否能够逆转布比卡因诱导的N2a细胞凋亡现象。当将布比卡因与N2a细胞共孵育24小时,细胞凋亡率比对照组增加了8.5倍(P<0.01)。然而,如果用高车前素预处理细胞,布比卡因诱导的细胞凋亡被抑制了73.6%,和对照组相比有明显差异(P<0.01)。然后,我们在不同时间点(36小时和48小时)检测高车前素对细胞的保护作用,以验证高车前素的保护作用不是由于延缓细胞凋亡的发生。布比卡因作用36小时和48小时后细胞的凋亡率分别增加83%和140%(P<0.05)。高车前素处理可以明显减少36小时和48小时布比卡因造成的细胞凋亡率,分别减少53.6%和54%(P<0.01)4高车前素抑制布比卡因诱导的线粒体膜电位损伤和Caspase-3的裂解既往研究提示布比卡因可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡。而Capase-3的裂解在线粒体介导的细胞凋亡过程中发挥了重要作用,因此,我们检测了线粒体膜电位和Caspase-3的变化。结果显示,布比卡因可以明显降低N2a细胞的线粒体膜电位(P<0.05)。流式细胞仪检测结果表明高车前素可以明显降低布比卡因造成的线粒体膜电位损伤。接下来,我们检测了线粒体途径介导细胞凋亡的标志物即裂解的Caspase-3。布比卡因可以明显的增加N2a细胞中Caspase-3的水平,这进一步表明布比卡因是通过线粒体途径诱导细胞凋亡发生。然而,高车前素可以抑制裂解的Caspase-3的表达水平。以上结果表明高车前素抑制布比卡因造成的细胞凋亡是通过线粒体途径实现的。5高车前素抑制布比卡因诱导的AMPK的失活最近研究提示AMPK信号通路参与了神经元细胞的存活状态的调节。我们检测了AMPK是否在高车前素抑制布比卡因诱导的神经元损伤中发挥作用。结果表明布比卡因可以降低AMPK和GSK3P的磷酸化水平,而高车前素可以明显逆转此过程。6AMPK抑制剂消除了高车前素所致的AMPK和GSK3β的磷酸化水平的增加复合物C是AMPK的特异性抑制剂。本实验采用复合物C来检测AMPK通路是否介导了高车前素的抗布比卡因细胞损伤作用。结果表明相对于未经复合物C处理的细胞,在使用复合物C处理后各组细胞的AMPK和GSK3β的磷酸化水平均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。7AMPK抑制剂降低了高车前素对布比卡因诱导细胞活力下降的保护作用本实验结果表明复合物C单独作用并不能明显的改变高车前素对细胞存活率的影响。然而,复合物C可以加剧布比卡因导致的神经细胞损伤。而且复合物C预处理细胞后,高车前素对N2a细胞的保护性作用降低,和未使用复合物C处理组相比,N2a细胞的存活率降低了31.8%(P<0.05)。这些结果提示抑制AMPK通路可以明显降低高车前素对布比卡因造成的N2a细胞损伤的保护性作用。8AMPK抑制剂减弱了高车前素对布比卡因诱导的细胞凋亡的保护性作用在布比卡因处理组,使用AMPK抑制剂预处理N2a细胞可以增加细胞9.1%的凋亡率,而在布比卡因和高车前素共同作用组,使用AMPK抑制剂预处理细胞后细胞凋亡率增加了397.8%。可见,使用AMPK特异性抑制剂复合物C处理后,高车前素对布比卡因造成细胞凋亡的抑制性作用明显减弱,差异有统计学意义(P<0.01)。9AMPK抑制剂减弱高车前素的细胞保护作用是通过加剧线粒体功能异常实现的与对照组相比,在布比卡因组,使用AMPK特异性的抑制剂复合物C预处理可以降低12.9%的线粒体膜电位,而在高车前素和布比卡因联合作用组,复合物C可以降低31.8%的线粒体膜电位。另外,在布比卡因组和布比卡因与高车前素联合处理组,复合物C处理可以明显增加裂解的Capase-3表达水平。这些结果表明AMPK抑制剂可以减弱高车前素对布比卡因导致的细胞凋亡的保护作用,该作用通过加剧线粒体功能异常来实现。研究结论本研究在小鼠神经细胞瘤N2a细胞中,探讨了高车前素对布比卡因导致的神经毒性损伤的影响及其相关机制。实验结果表明,布比卡因使N2a细胞的存活率降低。高车前素可以逆转布比卡因造成的N2a细胞的损伤作用,并可减少布比卡因导致的N2a细胞凋亡。高车前素的上述作用与其抑制布比卡因诱导的线粒体膜电位损伤和Caspase-3的裂解有关。本实验进一步研究提示,高车前素可以抑制布比卡因诱导的AMPK的失活,应用AMPK特异性抑制剂消除了高车前素所致的AMPK和GSK3β的磷酸化水平的增加,同时AMPK抑制剂也降低了高车前素对布比卡因所致的细胞损伤的保护作用,减弱了高车前素对布比卡因诱导的细胞凋亡的保护性作用。AMPK抑制剂减弱高车前素的细胞保护作用是通过加剧线粒体功能异常实现的。总之,本研究的实验结果证实了高车前素可以减弱布比卡因诱导的神经细胞损伤作用,这种作用至少部分是通过激活AMPK信号通路实现的。本研究结果是在体外细胞实验中获得的,在体内实验中是否成立仍需要进一步研究,这些结果提示高车前素对布比卡因所致神经毒性具有治疗作用。