第一章：母系遗传线粒体性耳聋1555A>G突变大家系临床分子研究线粒体DNA或编码线粒体蛋白的核基因发生改变,导致氧化磷酸化异常,细胞不能产生足够的ATP而导致细胞功能减退甚至坏死,即线粒体病。临床表型的异质性是线粒体疾病的典型特征,而表型的异质性一直原因不清。线粒体1555A>G突变是引起药物性耳聋和非综合性耳聋最常见的原因,携带此突变的家系呈现多变的临床表型和不完全的外显率,具体机制是不清楚和复杂的。我们对一个6代100余人的中国大家系进行了临床、分子、阈值、核基因GJB2、TRMU以及线粒体单体型的分析,以期了解线粒体单体型、环境因素、核基因背景、线粒体1555A>G突变拷贝数在此携带线粒体1555A>G突变家系中的作用。在临床听力评估中我们尝试用高频测听方法,发现没有接触氨基糖甙类药物的家系成员听力图呈现一定的规律性,听力损失最早出现在12kHZ,继之听力损伤从超高频12kHz延伸到高频8kHz、4kHz。我们用焦磷酸测序检测到同质1555A>G变变和1555A>G异质突变,除一人携带异质性1555A>G突变外其余均为同质性1555A>G突变,1555A>G变变的阈值和耳聋临床表型无关。在核修饰基因GJB2检测中,携带1555A>G突变的母系成员中7人检测到杂合的T123N,其中携带T123N和1555A>G的母系成员中使用氨基糖甙类药物者比未使用氨基糖甙类药物者听力损失严重,未使用氨基糖甙类药物者且同时携带T123N和1555A>G的个体比只携带1555A>G的个体听力损失更为严重。核基因TRMU第一外显子的检测未见有意义突变A10S。此家系所有母系成员进化树分析为线粒体单体型B4C1C,有趣的是和一个以前已报道的中国家系同属于单体型B4C1C,当氨基糖甙类药物作用计算在内时,两家系的外显率分别是63.6%和5.9%,去除氨基糖甙类药物作用的影响,外显率分别是51.5%和0%。虽然两个中国家系分享同样的单体型并且同样缺乏可能提高外显率的功能性二级突变,却呈现出完全不同的外显率。试验结果提示该家系耳聋的高外显率和单体型B4C1C、1555A>G变变阈值关系并不密切,因此我们推测此家系较高的外显率起主要作用的是环境和/或核修饰基因。氨基糖甙类药物和其他未知的核基因可能是决定性因素。第二章：核基因TFB1M、TRMU对耳蜗线粒体及毛细胞的作用机制研究背景：母系遗传线粒体耳聋是遗传性耳聋的一种,但是精确的线粒体缺失导致组织特异性的耳聋的病理机制目前不清。最常见的线粒体耳聋是A1555G突变,临床异质性一直是研究A1555G突变的难点。核基因可能是线粒体耳聋A1555G突变的临床表型的修饰因子。寻找线粒体A1555G突变的核修饰基因最理想的方法就是研究具有相同A1555G突变但临床表型不同的家系成员的耳蜗细胞表达差异。因为无法获取耳蜗组织,所以采用早期的家系连锁分析方法,定位了TRMU、MT01、TFB1M、GTPBp3这四个核基因和线粒体RNA修饰有关。而mtTFBIM和线粒体耳聋综合症的潜在的关系被注意是因为在KsgA缺乏的大肠杆菌株表达h-mtTFBl后可以恢复16S茎环的甲基化和对氨基糖甙类药物(春雷霉素)的敏感性。TFBM、TFAM、mtRNA聚合酶是哺乳动物线粒体转录机制核心组成部分,在线粒体生物合成中起着至关重要的作用。TFBM由核基因编码转运至线粒体。有研究发现A1555G突变同TFB1M过表达相似,可以导致12S rRNA超甲基化,导致相同的有缺陷的逆向线粒体合成信号,诱导对压力改变易凋亡的易感细胞。而线粒体12S rRNA的甲基化是维持哺乳动物核糖体必需的,12S rRNA甲基化有可能是以前未认识到的线粒体合成的异常信号。鉴于没有一个真正意义的具有类似A1555G线粒体DNA突变的老鼠模型,因此设想观察新霉素诱导下小鼠核基因TFB1、TRMU、耳蜗线粒体、毛细胞凋亡的相互关系。即外源化合物作用于耳蜗毛细胞,细胞核、线粒体基因是否会发生交互作用,导致耳聋/毛细胞凋亡的发生、发展。研究目的：线粒体核修饰基因TFB1M、TRMU与正常耳蜗毛细胞和新霉素致损的耳蜗毛细胞和线粒体的作用机制。研究方法：1、采用新生1-2天小鼠听觉上皮体外无血清培养模型,建立新霉素致损模型。2、活细胞动态检测线粒体膜电位的变化,了解线粒体的功能。3、检测基因TFB1M、TRMU在听觉上皮细胞核和线粒体中的表达以及部分凋亡相关基因的表达。结果：在新霉素致损4小时后,尽管基底膜中圈外毛细胞形态完整,但是已经出现线粒体膜电位的改变；新霉素致损4小时洗脱后3小时,线粒体底圈、中圈膜电位消失,在底圈、中圈出现散在死亡的毛细胞,底圈较中圈多,顶圈未见死亡细胞。新霉素致损12小时线粒体底圈、中圈大量毛细胞缺失,并导致膜电位明显降低；24小时线粒体膜电位完全消失,caspase9、caspase8表达高。新霉素致损12小时,耳蜗听觉上皮细胞线粒体以及核内的TFB1M表达上调,在此时间点同时出现线粒体膜电位的改变、外毛细胞大量消失。新霉素致损24小时洗脱后48小时出现caspase7、caspase9、caspase8高表达,caspase3、XIAP低表达。听觉上皮细胞核内TFB1M蛋白的表达稍低,TRMU的表达在两组无明显差异。结论：1、新霉素致损小鼠基底膜洗脱期的凋亡途径可能存在线粒体之外的其他途径。2、在新霉素致损洗脱期,RNA修饰基因TRMU和RNA甲基转移酶TFB1M表达无明显改变。3、在新霉素致损12小时,细胞核内基因TFB1M蛋白质水平的表达上调,并且和线粒体膜电位消失、外毛细胞大量丢失共存。TFB1M蛋白质水平的表达上调可能导致12S rRNA超甲基化,继而影响毛细胞凋亡和线粒体功能丧失。TFB1M蛋白质水平的表达上调导致的12S rRNA超甲基化可能对毛细胞的线粒体合成起副效应。