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杧果(MangiferaindicaL.)人们俗称芒果,漆树科(Anacardiaceae)常绿乔木,主要分布于热带、亚热带地区,是世界上著名的五大热带名果之一。杧果果实成熟时的颜色直接影响人们的喜爱程度,从而决定杧果的商品价值,而这些颜色的形成离不开叶绿素降解途径。本实验选取三个不同着色杧果品种(红色’贵妃’品种、黄色’金煌’品种、绿色’桂七’品种)的果皮为试验材料,通过对杧果MiPAO和MiRCCR基因的克隆、生物信息学分析、表达分析、果实着色相关生理指标的测定、构建病毒诱导的基因沉默载体和植物过量表达载体以Micro-Tom番茄为研究对象进行转基因植物功能研究,以此明确杧果MiPAO和MiRCCR基因在杧果果皮叶绿素降解中的作用。主要研究结果如下:1、成功克隆了MiPA 和MiRCCR基因,并进行了生物信息学分析。采取3’和5’cDNA末端快速克隆(RACE)的技术方法,分别在三个不同着色杧果品种中克隆得到了杧果果皮PAO和RCCR基因的全长cDNA序列,生物信息学分析后将其命名为MiPAO和MiRCCR。结果发现三个着色品种中的MiPAO和MiRCCR基因cDNA序列只有几个碱基的差异,以红色’贵妃’杧果为例,分析可得MiPAO基因全长cDNA序列为1979bp,开放阅读框为1641bp,编码546个氨基酸,分子重量为61.816KD,等电点为6.54。以黄色’金煌’杧果为例,分析可得MiRCCR基因全长cDNA序列为1134 bp,开放阅读框为975 bp,编码324个氨基酸,分子重量为36.21 kD,等电点为5.13。通过生物软件预测得到了MiPA 和MiRCCR基因的三种三级蛋白结构图。利用NCBI上登录的30种不同植物的序列构建系统发育树,发现MiPAO基因编码的蛋白与橙子等果树的亲缘关系较近,MiRCCR基因编码的蛋白与橙子、克莱门柚等果树的亲缘关系较近。2、测定了三个不同杧果品种果皮着色相关的生理指标。应用分光光度法测定软熟期叶绿素的含量,结果发现绿色’桂七’杧果的叶绿素a、叶绿素b以及总叶绿素含量明显高于红色’贵妃’和黄色’金煌’,而黄色’金煌’的叶绿素含量最低。通过HPLC液相测定杧果软熟期果皮花色素苷主要组成成分和β-胡萝卜素的含量,结果表明,飞燕草素-3-O-半乳糖苷是红色’贵妃’杧果和黄色’金煌’杧果果皮花色素苷的最主要成分。锦葵色素-3-O-半乳糖苷是绿色’桂七’杧果果皮花色素苷的最主要成分。红色’贵妃’杧果果皮β-胡萝卜素的含量是黄色’金煌’杧果果皮的4.6倍,是绿色’桂七’的9.1倍,这说明’贵妃’杧和’金煌’杧在成熟时最终果皮颜色的形成与β-胡萝卜素的积累量有密切的相关性。3、分析了MiPAO 和MiRCCR基因在三个品种果皮中的表达量。通过qRT-PCR检测MiPAO和MiRCCR基因在软熟期三个品种果皮中的表达量。结果显示,在绿色’桂七’中MiPAO和MiRCCR基因的相对表达量均最高,红色’贵妃’其次,而在黄色’金煌’中的表达量均最低。4、构建了病毒诱导的基因沉默载体和植物过量表达载体以Micro-Tom番茄为研究对象进行了转基因植物功能的研究。利用克隆得到的MiPAO和MiCCR基因序列成功构建了 pTRV2-MiPAO和pTRV2-MiRCCR基因沉默载体,以及pGreenⅡ 62-SK-MiPAO和pGreenⅡ 62-SK-MiRCCR过量表达载体。利用农杆菌介导注射法在开花一周后果柄注射和绿果期果皮注射两种注射侵染方式,转化Micro-Tom番茄。结果发现注射果柄Micro-Tom番茄的表型较注射果实表面的表型更明显更直观,效果更好。通过Micro-Tom番茄表型的观察、叶绿素和类胡萝卜素含量的测定以及半定量PCR检测,Micro-Tom番茄SlPAO和SlRCCR基因被沉默会在注射点附近区域抑制叶绿素的降解,出现果实颜色差异和部分滞绿,与此同时类胡萝卜素的合成和积累也受到抑制。而杧果MiPAO和MiRCCR在Micro-Tom番茄中过量表达会加快番茄转色,表现出“早熟”的特征。这为杧果果实成熟过程中果色的形成和色泽调控提供一定的实验支持,同时也为生产上杧果果实颜色的把控和成熟期的调节提供一定的理论依据。