小鼠胚胎干(Embryonic stem,ES)细胞与四倍体胚胎有不同的发育潜能,四倍体胚胎仅参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系(如绒毛膜外胚层、滋养巨细胞等)的生成,而ES细胞广泛参与胚体、羊膜、尿囊、卵黄囊中胚层和绒毛膜中胚层的生成,不参与卵黄囊内胚层和胎盘滋养细胞谱系的生成。利用四倍体胚胎补偿技术,将ES细胞与四倍体胚胎嵌合,就可以得到完全由ES细胞发育而来的小鼠,即ES小鼠。所有的克隆动物都是不正常的,这是由于供体细胞基因组异常的表观遗传状态所致,那些存活至成年或活的稍长一点的克隆动物只是比早死的克隆动物少一些异常而已。克隆动物后代的异常表型与其重构胚早期发育过程中的异常表观重编程epigenetic reprogramming)有关。异常的表观重编程可以导致异常的基因表达,从而引起克隆动物的诸多异常表型。而DNA甲基化(DNA methylation)是真核生物基因的一种重要的表观遗传修饰方式,是调节基因组功能的重要手段,在胚胎的正常发育过程中具有显著作用。通过对DNA甲基化模式的研究发现,克隆动物中存在着异常的DNA甲基化状态,而这些异常的DNA甲基化模式可能就是导致克隆胚早期死亡以及克隆动物发育畸形的主要原因。已有研究表明,印迹基因的异常表达会造成克隆动物发育异常,而调节印迹基因表达的主要分子机制就是DNA甲基化。据此我们推测:与正常个体相比,新生死亡的克隆动物印迹基因的甲基化状态很可能发生了某些变化。以ICR小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,利用高糖DMEM作为基础培养基,同时添加15%的胎牛血清、0.1mM的2-巯基乙醇、1%的非必需氨基酸、2mM的L-谷氨酰胺、1000IU/mL的白血病抑制因子(LIF)以及青、链霉素各50IU/mL。5% CO2、饱和湿度、37℃培养,由37枚C57BL/6J×129/Sv囊胚内细胞团分离获得3株ES细胞系。酚提法提取遗传背景(C57BL/6J×129/sv)相同的正常成年小鼠、正常新生小鼠、成年ES小鼠和新生死亡ES小鼠的尾部组织基因组DNA,利用甲基化敏感性限制性内切酶(methylation sensitive restriction endonuclease, MS-RE)-PCR技术分别检测了各实验组印迹基因(imprinted gene)H19 5’非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明,发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与对照组正常成年小鼠、正常新生小鼠之间都没有差异,而新生死亡ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠、正常成年小鼠以及正常新生小鼠相比则存在明显差异。挑选生长状态良好的ES细胞(C57BL/6J×129/sv)集落,纯化后利用上述相同的方法提取ES细胞基因组DNA并检测其印迹基因H19 5’非翻译区两个位点的甲基化状态。从研究结果推测,ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠、正常成年小鼠以及正常新生小鼠之间可能存在差异,而不同传代次数的ES细胞之间印迹基因H19所检测位点的甲基化状态差异并不明显。