2015~2017年华南地区PCV2和PCV3分子流行病学调查及PCV3实时荧光定量PCR方法的建立

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wutsc
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猪圆环病毒(Porcine Circovirus,PCV)是一种无囊膜的环状DNA病毒,目前已鉴定存在三种不同型的猪圆环病毒,分别是PCV1、PCV2和PCV3。PCV1被认为对猪无致病性,而PCV2是生猪产业中重要的病原之一,是引起猪圆环病毒相关疾病的主要病原,猪圆环病毒病也是导致全球养猪业重大经济损失的疾病之一,并在全球范围内广泛流行。其主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征、繁殖障碍等。PCV3是美国学者Palinski、Phan在2016年从猪群中新发现的一种环状病毒。美国猪群中发现PCV3以后,相继有文献报道在美洲、亚洲、欧洲、南美洲地区的猪群中均检测存在PCV3。PCV3的临床意义尚未得到很好的阐述,其致病性需进一步研究。为了解华南地区猪群中PCV2的流行及感染情况,本研究对华南地区猪群开展了PCV2的病原学和血清学调查。2015年1月至2017年12月从华南地区各规模化猪场采集了10293份猪血清样品和877份组织样品分别用于抗体检测和病原检测。结果表明,近三年PCV2血清抗体总阳性率达90.25%,且PCV2血清抗体阳性率逐年增加;近三年抗原总阳性率为30.33%,不同年份抗原阳性率差异较大。病原学和血清学的结果表明华南地区猪群感染PCV2的现象十分普遍。为进一步了解华南地区猪群中PCV2的主要流行毒株及其遗传变异情况,本研究对PCV2抗原检测为阳性的样品进行PCV2全基因组测序,共获得117条PCV2毒株的全长序列,分析表明117条PCV2全基因组的核苷酸同源性在93.6%~100%。遗传演化分析结果显示,其中57个毒株属于PCV2d分支,40个毒株属于PCV2a分支,20个毒株属于PCV2b分支。这表明PCV2a、PCV2b、PCV2d三种基因型在华南地区猪群中共同流行,主要的流行毒株是PCV2d;通过对ORF1、ORF2基因序列的分析结果表明,ORF1基因十分保守,ORF2基因编码的Cap蛋白存在不同位置的突变位点,主要是52~91 aa、121~151 aa、185~215 aa区域。为了解PCV3在华南地区猪群中的流行特点和遗传演化情况,本研究对2015年1月至2017年6月采集的285份组织病料进行回溯性的流行病学调查。病原学调查结果显示,PCV3抗原阳性率呈现逐年增加的趋势,总阳性率为26.7%。PCV3还存在与PCV2、PRRSV的混合感染。另外,PCV3具有广泛的组织嗜性,可以从肺脏、扁桃体、淋巴结、肾脏和流产胎儿组织中检测到PCV3的存在,并且在流产胎儿中检出率最高。对PCV3 Cap基因的遗传演化和分子特征分析结果表明,基于Cap蛋白两个氨基酸位点的突变(A24V和R27K)可以将PCV3分成三个不同的分支(PCV3a、PCV3b、PCV3c);贝叶斯遗传演化分析结果表明,PCV3可能起源于蝙蝠相关的圆环病毒,起源时间大约是1966年,表明PCV3可能在猪群中流行近半个世纪。本研究结果表明PCV3在华南地区猪群中广泛流行,并且具有一定的遗传多样性。此外,本研究基于SYBR Green I染料法,在PCV3 ORF2基因序列的保守区域设计一对特异性引物,通过优化反应条件最终成功构建PCV3 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法灵敏度较高,最低检出限为7.68×10~1copies/μL。该检测方法特异性强,与PCV2、PPV、PRV、PRRSV、CSFV、SIV基因组均无交叉扩增;重复性高,测定的批间和批内变异系数均小于1.5%。极高的灵敏度、良好的特异性和重复性表明该方法可用于临床样品PCV3的检测。综上所述,本研究对华南地区猪群中PCV2和PCV3进行了系统的流行病学调查,揭示了华南地区猪群中PCV2的主要流行毒株和遗传变异情况,并证实了新发PCV3在华南地区猪群中也广泛存在和流行,揭示PCV3在猪体内的组织分布情况和遗传演化历史,并且成功构建了PCV3 q PCR检测方法,为监测PCV2和PCV3的流行规律及防控、致病机制的相关研究奠定基础。
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