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目的:研究蟾毒灵对胃癌侵袭转移的影响,从抑制Wnt/ASCL2信号通路进而抑制EMT角度揭示蟾毒灵抗胃癌的作用机制。方法:(1)体外培养人胃癌AGS细胞,分为对照组、蟾毒灵组和奥沙利铂组(Oxaliplatin),采用MTT和克隆形成实验观察蟾毒灵对胃癌细胞增殖的影响;采用划痕实验和Transwell小室实验观察量蟾毒灵作用后胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化;Western-blot检测蟾毒灵对侵袭转移相关基因E-cadherin、MMP2、MMP9表达的影响。(2)体外培养人胃癌细胞,采用sh RNA-ASCL2干扰慢病毒感染AGS细胞,构建ASCL2低表达细胞株,采用荧光定量PCR(RT-PCR)、Western-blot验证转染后ASCL2的表达;采用划痕实验和Transwell小室实验观察ASCL2表达对胃癌细胞侵袭迁移能力的影响;平板克隆形成实验观察ASCL2基因对胃癌细胞成克隆能力的影响;Western-blot检测ASCL2对基因E-cadherin、MMP2、MMP9蛋白表达的影响;(3)采用RT-PCR、Western-blot检测蟾毒灵及蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2对胃癌细胞ASCL2、EMT及侵袭转移相关基因表达的影响,免疫荧光检测蟾毒灵及蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2对E-cadherin、Vimentin表达的影响。采用Wnt信号通路抑制剂XAV-939观察Wnt/ASCL2通路在蟾毒灵抑制胃癌侵袭迁移中的作用机制;并采用Western-blot检测XAV-939及联合蟾毒灵对侵袭转移相关基因及EMT相关基因表达的影响。(4)构建胃癌裸鼠皮下移植瘤模型,分为对照组、sh RNA-control组、sh RNA-ASCL2组、蟾毒灵组、蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合sh RNA-ASCL2组,观察沉默ASCL2及联合蟾毒灵对胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤成瘤的影响,每组5只裸鼠;TUNEL法检测各组移植瘤凋亡指数;免疫组化、Western-blot检测ASCL2、凋亡相关基因、Wnt信号通路相关基因、EMT相关基因表达。结果:(1)蟾毒灵可以抑制胃癌AGS细胞增殖,其抑制作用与剂量呈正相关;划痕实验和Transwell小室实验显示:与对照组相比较蟾毒灵能够抑制胃癌细胞侵袭迁移(P<0.01),与奥沙利铂组相比较未见明显差异(P>0.05);Western-blot结果显示:与对照组相比较蟾毒灵组E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.01),而MMP2和MMP9表达明显下调(P<0.01),蟾毒灵组和奥沙利铂组相比较未见明显差异(P>0.05)。(2)sh RNA-ASCL2慢病毒感染AGS细胞后成功下调了基因ASCL2的表达,构建了ASCL2低表达细胞株;划痕实验和Transwell小室实验显示干扰ASCL2基因表达后胃癌细胞侵袭迁移能力明显下降(P<0.01);平板克隆显示干扰ASCL2基因表达能够抑制胃癌细胞成克隆能力(P<0.01);Western-blot结果显示干扰ASCL2基因表达能够上调E-cadherin蛋白表达,同时下调MMP2和MMP9表达(P<0.05)。(3)蟾毒灵作用胃癌细胞后ASCL2表达明显降低,联合sh RNA-ASCL2时其作用更加明显,同时奥沙利铂作用后ASCL2表达也明显下调(P<0.05);当蟾毒灵与奥沙利铂联用时对ASCL2的抑制作用优于单用蟾毒灵或者奥沙利铂(P<0.05)。蟾毒灵与sh RNA-ASCL2联用时胃癌细胞侵袭能力明显降低,细胞穿膜细胞数与单用蟾毒灵或单用干扰ASCL2时更少(P<0.01);Western-blot结果显示蟾毒灵和sh RNA-ASCL2联用时E-cadherin表达升高更加明显(P<0.05);蟾毒灵和奥沙利铂均能抑制Vimentin、MMP2表达,当蟾毒灵和sh RNA-ASCL2联用时抑制作用更加明显(P<0.05),但蟾毒灵和奥沙利铂组相比较未见明显差异(P>0.05)。Transwell结果显示应用Wnt通路抑制剂XAV-939后胃癌细胞的侵袭能力明显降低(P<0.05),当蟾毒灵联合Wnt抑制剂时侵袭能力降低更加明显(P<0.01)。Western-blot结果显示应用Wnt抑制剂后ASCl2、β-catenin、Vimentin蛋白表达下调,E-cadherin表达上调(P<0.05)。蟾毒灵联合Wnt抑制剂与单用蟾毒灵组相比较ASCL2、β-catenin、Vimentin表达抑制作用更加明显(P<0.05)。(4)体内实验结果显示,sh RNA-ASCL2组、蟾毒灵组、蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合sh RNA-ASCL2组裸鼠移植瘤体积与对照组相比较明显降低(P<0.01),蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2组对肿瘤抑制作用明显优于单用蟾毒灵和单纯sh RNA-ASCL2组(P<0.05);奥沙利铂联合sh RNA-ASCL2组优于单用奥沙利铂组和单纯sh RNA-ASCL2组(P<0.01);蟾毒灵组与奥沙利铂组相比较未见明显差异(P>0.05);TUNEL结果显示sh RNA-ASCL2组、蟾毒灵组、蟾毒灵联合和单纯sh RNA-ASCL2组、奥沙利铂组、奥沙利铂联合sh RNA-ASCL2组凋亡指数与对照组相比较明显降低(P<0.05),且联合组优于单用组(P<0.01);Western-blot结果显示sh RNA-ASCL2组、蟾毒灵组、蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2组凋亡相关基因Bax、Caspase-3表达上调,而Bcl-2表达下调(P<0.01);同时侵袭转移相关基因MMP2、MMP9表达下调(P<0.05);EMT相关基因E-cadherin表达上调,而Vimentin表达下调(P<0.05),且蟾毒灵联合sh RNA-ASCL2组的作用较单纯使用蟾毒灵或者单纯使用sh RNA-ASCL2组效果更加明显(P<0.05)。结论:(1)蟾毒灵能够在体内外抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移;(2)沉默ASCL2能在体内外抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移;(3)蟾毒灵抑制胃癌侵袭迁移的作用机制与抑制Wnt/ASCL2信号通路相关基因表达、进而抑制EMT有关。