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研究背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是一种因鼻咽上皮细胞癌变引起的常见肿瘤,其发病率较高,恶性程度高,易发生转移及复发。研究治疗鼻咽癌的药物及其靶点临床意义重大。微小核糖核酸(micro RNA,miRNA)是真核生物内源性短片段RNA,负责体内转录后水平基因调控。部分miRNA为抑制肿瘤mRNA,其中大量研究发现miR-30a-5p家族参与抑制肿瘤发生、促进凋亡和抑制转移等过程。目的探讨miR-30a-5p和CD73在鼻咽癌中差异性表达及其临床意义,并在体外通过基因干扰试验、miRNA转染及拯救试验研究miR-30a-5p通过调控CD73对鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响及机制,研究miR-30a-5p和CD73的作用靶点及信号通路,为鼻咽癌的诊断和治疗探寻潜在的靶标。方法q-PCR分析及对比了20例鼻咽炎患者及94例鼻咽癌组织中miR-30a-5p和CD73mRNA水平,western blot法、免疫组织化学检测分析了CD73蛋白表达,分析其与鼻咽癌的临床病理特征之间的关系,随访50个月各鼻咽癌患者生存和预后情况,评估了miR-30a-5p及CD73对鼻咽癌作用及其机制。并且通过q-PCR和western blot法,从基因水平和蛋白水平对比了鼻咽正常细胞株及4种不同品系的鼻咽癌细胞,NP69细胞和CNE-2细胞、5-8F细胞、CNE细胞、6-10B细胞中CD73和miR-30a-5p水平。采用q-PCR和western blot法,验证miR-30a-5p过表达载体和CD73干扰载体是否成功构建。通过转染CNE-2细胞获得过表达miR-30a-5p的细胞和CD73表达抑制的细胞,以正常CNE-2细胞为对照,通过CCK-8法对比其细胞增殖水平,通过Transwell实验对比其细胞侵袭能力,通过划痕试验对比其迁移能力,通过Annexin V-FITC/PI双染法对比其细胞凋亡水平。通过qPCR和western blot法,从基因及蛋白水平测定过表达miR-30a-5p的细胞、CD73表达抑制的细胞及正常CNE-2细胞的磷酸化细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)的表达情况,以研究miR-30a-5p抑癌的细胞信号通路机制。采用生物信息学软件预测了miR-30a-5p和CD73 mRNA结合位点,并通过双荧光酶素靶基因实验验证了以上结合位点的正确性。最后,设计了拯救实验,通过转染miR-30a-5p和CD73过表达载体至CNE-2鼻咽癌细胞,与仅转染了miR-30a-5p过表达载体和空载体的CNE-2细胞对比,进行qPCR、western blot法、CCK-8法、Transwell实验、划痕试验及Annexin V-FITC/PI双染法,进一步证明miR-30a-5p抑制鼻咽癌的靶点及机制。结果1)鼻咽癌组织中miR-30a-5p水平显著低于鼻咽炎患者的鼻咽部组织中miR-30a-5p水平(P<0.05)。2)鼻咽癌组织中CD73的基因水平和蛋白水平均显著高于鼻咽炎患者的鼻咽部组织中CD73水平(P<0.05)。3)不同患者鼻咽癌组织中miR-30a-5p和CD73水平有差异,二者之间呈明显负相关,具有显著统计学差异(R=-0.530,P=0.000)。miR-30a-5p表达水平与TNM分期、远处转移之间具有明显统计学差异(P<0.05),与年龄、性别之间无统计学差异(P>0.05)。按照miR-30a-5p表达水平高低,将94名患者分为高表达组1(n=52)、低表达组1(n=42)。高表达组1在10个月、20个月、30个月、40个月及50个月随访点时,生存时间均显著优于低表达组1(P<0.05)。4)CD73 mRNA表达水平与TNM分期、远处转移之间具有明显统计学差异(P<0.05),与年龄、性别之间无统计学差异(P>0.05)。按照不同患者鼻咽癌组织中CD73mRNA的水平高低,将94名患者分为高表达组2(n=46)、低表达组2(n=48)。低表达组2在20个月、30个月、40个月及50个月随访点时,生存时间均显著高于高表达组2(P<0.05)。5)miR-30a-5p在体外鼻咽癌细胞过表达使CD73表达量显著下调(P<0.05)。6)免疫组化实验鼻咽癌IOD值为391538±42281,鼻咽炎IOD值为150631±23193,鼻咽癌较鼻咽炎组织CD73表达量显著提高(P<0.05)。7)细胞划痕试验发现,CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达,划痕愈合速度均为35μm/d,较正常CNE-2细胞的划痕愈合速度110μm/d显著下降(P<0.05),迁移速度下降。CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达均能显著抑制CNE-2细胞的迁移能力。8)Transwell实验结果发现,CD73表达量下调后较正常CNE-2细胞侵袭抑制率为64.66%±3.41%,miR-30a-5p过表达后侵袭抑制率为60.82%±3.45%,均能显著抑制CNE-2细胞的侵袭能力(P<0.05)。9)Annexin V-FITC/PI双染法结果发现,通过流式细胞仪测定了转染后细胞及正常CNE-2细胞的凋亡率。通过凋亡实验证明,CD73表达量下调后早期凋亡率为11.8%、晚期凋亡及死细胞率为11.9%、总凋亡率分别为23.7%。miR-30a-5p过表达后早期凋亡率为11.9%、晚期凋亡及死细胞率为16.4%、总凋亡率为28.3%,较正常CNE-2细胞的早期凋亡率1.85%、晚期凋亡及死细胞率1.49%、总凋亡率3.34%,均能显著提高CNE-2细胞的早期凋亡率、晚期凋亡及死细胞率、总凋亡率。10)CCK-8法测定CNE-2细胞的细胞增殖水平的结果显示,在24h和48h时,CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达,均能显著降低CNE-2细胞的增殖水平,且培养时间越长,增殖水平抑制越显著。48h CD73表达量下调和miR-30a-5p过表达的增殖抑制率分别为64.66%±3.41%,60.82%±3.45%,说明miR-30a-5p能通过下调CD73水平,抑制鼻咽癌细胞的增殖。11)miR-30a-5p和CD73含量对AKT无显著影响。miR-30a-5p能抑制ERK的表达。12)通过生物信息学软件预测了miR-30a-5p与CD73结合的靶点为CD73 mRNA3’UTR区域的328至355及1442至1449位点的UGUUUACA。13)通过双荧光素酶报告基因发现转染了psi CHECK-CD73-WT质粒和hsa-miR-30a-5p的CNE-2细胞中Firefly luciferase与Renilla luciferase比值较转染mimics NC对照显著下降(P<0.05)。14)通过挽救试验,进一步证明了miR-30a-5p是一种鼻咽癌抑制性因子,能在体外通过负调控CD73水平,抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。结论1)鼻咽癌组织中miR-30a-5p水平显著低于鼻咽炎组织中miR-30a-5p水平,鼻咽癌组织中CD73的基因水平和蛋白水平均显著高于鼻咽炎组织中CD73水平。2)miR-30a-5p在鼻咽癌组织及多种鼻咽癌细胞株中低表达;miR-30a-5p高表达利于鼻咽癌患者生存,miR-30a-5p对于鼻咽癌发挥了抑癌基因的作用。3)CD73在临床鼻咽癌组织及多种鼻咽癌细胞株中高表达;CD73的高表达与鼻咽癌临床不良预后呈正相关。4)miR-30a-5p的靶基因之一是CD73 mRNA,CD73参与miR-30a-5p抑制肿瘤细胞的过程,miR-30a-5p通过下调CD73的表达,达到抑瘤作用。5)不同细胞系的miR-30a-5p和CD73水平有差别,其中CNE-2细胞较NP69细胞、5-8F细胞、CNE细胞和6-10B细胞的miR-30a-5p水平更低,CD73水平更高。CNE-2细胞是一种用于研究miR-30a-5p和CD73适宜的鼻咽癌细胞系。6)过表达miR-30a-5p可下调鼻咽癌细胞中CD73 mRNA及蛋白水平,抑制鼻咽癌细胞体外增殖率、促进凋亡、抑制迁移及侵袭。7)干扰CD73表达可抑制鼻咽癌细胞体外增殖率、抑制迁移及侵袭、促进凋亡。8)miR-30a-5p下调CD73 mRNA表达抑制鼻咽癌细胞体外增殖、迁移、侵袭及促进凋亡是通过ERK和PI3K/AKT信号传导通路实现的。9)CD73 mRNA的启动子区域有潜在的miR-30a-5p结合位点,结合的靶点为CD73mRNA 3’UTR区域的328至355及1442至1449位点的UGUUUACA。10)过表达CD73能拯救过表达miR-30a-5p引起的抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移、侵袭能力及促进凋亡的作用。