幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)感染是儿童慢性胃炎和消化性溃疡的主要病因,与胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤和胃癌的发病机制密切相关。一般认为,HP是细胞外病原体,但越来越多的证据表明该细菌可以在胃上皮细胞中增殖,免疫反应很难去除细胞内的HP并引起胃部疾病的发生。正常平衡的微生物菌群对于建立和维持宿主免疫平衡中起着至关重要的作用。越来越多的动物和临床研究表明,胃肠道微生物群可以显著影响疾病免疫治疗的临床效果。HP感染能够引起机体天然和获得性免疫应答,可诱发细胞免疫和体液免疫反应。目前关于HP感染相关的细胞因子研究多集中于Th细胞相关的细胞因子。根据不同的细胞因子谱和生物学功能,效应性T细胞分为辅助性T细胞(Th1、Th2)和调节性T细胞(Treg)亚群。Treg是具有调节功能的T细胞亚群,其在免疫抑制作用中不同于Th1和Th2效应性T细胞,并且在多种免疫性疾病中发挥重要的调节作用,近年来已成为免疫学领域的热点。根据其表面标志物、产生的细胞因子和作用机制,Treg可分为CD4+CD25+Treg、Treg1和Th3等[4,5]。胃微生物群是胃黏膜免疫必不可少的调节因子。共生菌群的特定成员,如梭菌属和脆弱拟杆菌(荚膜多糖A产生),是天然forkhead盒蛋白3(Foxp3+Tregs)的强诱导剂。Foxp3+Tregs表达CD4+CD25+Treg,在调节胃肠道免疫稳态、促进外周耐受性的建立和维持方面的重要性在动物和人类实验中都得到了证实[6-8]。既往研究发现,寡养单胞菌具有免疫刺激作用,可诱导TNF-α表达,对炎症反应有明显的促进作用。进一步研究发现许多不占优势的胃细菌与两种主要的免疫抑制细胞有显著的相关性。这些细菌大多属于变形杆菌门和厚壁菌门,它们单独或与细菌代谢产物一起调节胃黏膜免疫[9]。既往研究大多以肠道环境为基础,侧重于微生物群与黏膜免疫之间的相互作用,而这些相互作用在胃中的研究相对较少。HP感染引起Tregs及Th17的活化和细胞因子的改变,可能引起胃炎和消化性溃疡。目前尚不清楚HP感染的胃黏膜相关微生物群与Tregs的改变是否相关及如何相关。HP感染在引起机体免疫反应的同时,还可诱导胃上皮细胞产生自噬,通过自噬可降解病原体而起到保护细胞的作用。研究发现HP诱导的自噬通过降解胞内的VacA减少了 HP对胃上皮细胞造成的损伤;但同时又观察到在自噬体中的HP只有一部分得到了清除,而另一部分HP能在自噬体中生存、增殖。目前HP激活宿主的自噬过程仍未完全明确,尽管涉及不同的细菌和宿主因素,但使用不同的菌株和宿主细胞系会产生不同的结果。HP如何调控或阻断自噬介导的病原体向溶酶体的转运有利于其自身在自噬体中的存活和复制的呢?研究发现除HP外,其它多种细菌均可操纵自噬(如沙门氏菌、志贺菌等),可以调节细胞膜表面,也可以表达效应器和毒素,干扰、操纵自噬,增加细胞内复制和进一步入侵的潜力。那么HP感染是否影响改变了胃黏膜相关微生物菌群呢?成人的研究报道了HP感染者胃黏膜菌群以HP为主,同时伴随着其他菌属的相对耗竭。HP感染患儿胃黏膜微生物群落的研究很少,国外研究提出HP感染患儿胃黏膜菌群中HP占绝对优势,但涉及样本量少。中国儿童HP感染状态下胃黏膜菌群结构特征及其对黏膜免疫功能的影响尚未见报道。综合上述,我们做出以下推测:HP感染影响改变了胃黏膜相关微生物菌群,改变的微生物菌群影响Tregs的合成与分泌,进而影响胃黏膜局部免疫功能和炎症反应。HP感染影响改变了胃黏膜相关微生物菌群,改变的微生物菌群是否影响胃上皮细胞的自噬过程呢?因此,研究微生物菌群对自噬调节有可能揭示HP慢性持续性感染引起的疾病发生机制。因此本研究拟结合动物实验,探讨HP感染胃黏膜相关微生物菌群改变与黏膜免疫因子、黏膜细胞自噬及相关通路的关系,证明HP感染对胃黏膜相关微生物菌群的影响及其调节局部免疫功能的作用及机制。目的:1.了解HP感染对胃黏膜及十二指肠黏膜相关微生物菌群的影响。2.明确HP感染对胃黏膜组织免疫相关因子及细胞因子水平的影响。3.阐明HP感染胃黏膜诱导自噬发生的过程及其信号通路变化。方法:选择从2016年12月至2017年8月因“反复腹痛、腹胀、恶心、呕吐”等症状就诊于浙江大学医学院附属儿童医院的患儿122例,分为三组:HP感染胃炎组患儿(HP 阳性组)57例,HP阴性胃炎组患儿(HP阴性组)37例,HP阴性胃黏膜镜下及组织病理学均无异常的患儿(对照组)28例,分别活检胃窦部和十二指肠球部黏膜进行以下研究。1.HP感染对儿童胃黏膜以及十二指肠黏膜微生态的影响取每例患儿胃窦部及十二指肠球部黏膜各1块,提取黏膜总DNA,通过PCR提取16S rDNA V4区序列,利用Illumina Miseq高通量测序平台测序测定三组间胃黏膜及十二指肠黏膜相关微生物菌群多样性变化。2.HP感染对胃黏膜组织免疫相关因子及细胞因子水平的影响及机制对于HP阳性组、HP阴性组和对照组儿童胃镜下活检的胃窦部黏膜,每组随机选取12例,提取胃窦部黏膜总RNA。采用实时定量聚合酶链反应分析FOXP3、IL-10、TGF-β、TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、IL-17A、IL-21、IL-23的基因表达情况。免疫组织化学染色观察CD4+T细胞及巨噬细胞(CD68)的表达情况。分析HP感染患儿CD4+T细胞、CD68细胞、FOXP3、IL-10、TGF-β、IL-17A、IL-23的表达特点及其相互关系。3.HP感染胃黏膜组织自噬发生过程及其信号通路变化每例患儿胃窦部黏膜各1块,分别用于提取组织总蛋白。另有6例(每组2例)活检胃窦部黏膜各1块予2.5%戊二醛固定后进行透射电镜观察,检测HP感染患儿胃黏膜组织细胞自噬小体形成。应用免疫印迹(Western-blot)技术检测HP感染患儿胃黏膜标本自噬标志性蛋白、自噬相关蛋白及相关信号通路蛋白。结果:1.基于细菌高通量测序分析证实儿童胃及十二指肠黏膜均存在大量细菌群落,且具有其独特的菌群特征和多样性。HP感染显著影响胃黏膜相关微生物群的α多样性和β多样性,但十二指肠黏膜相关微生物群落多样性影响不大。HP 阳性组患儿和HP阴性组患儿,组间胃黏膜细菌群落结构和多样性均存在显著差异,和HP阴性组相比,HP阳性组的6个门、5个纲、9个目、10个科、8个属的丰度水平显著降低;只有螺杆菌属的比例更为丰富。HP 阳性组患儿、HP阴性组患儿和对照组儿童十二指肠黏膜细菌群落结构和多样性均无显著差异。HP感染对十二指肠黏膜相关微生物群影响不明显,组间多个分类水平丰度无显著性差异。2.HP 阳性组 FOXP3、TGF-β1、IL-10、IL-17A、IL-23 的 mRNA 表达明显高于HP阴性组及对照组(p<0.01)。HP 阳性组FOXP3 mRNA水平与TGF-β1、IL-10的 mRNA 水平正相关(r=0.836,p<0.01;r=0.711,p<0.01),FOXP3 mRNA 水平与HP丰度正相关(r=0.833,p<0.001)。HP 阳性组CD4+T细胞及CD68细胞的数量均明显高于HP阴性组和对照组(p<0.05),CD4+T细胞的数量与炎症评分正相关(r=0.795,p<0.001),IL-17A mRNA/FOXP3 mRNA 比率与 HP 丰度负相关(r=-0.717,p<0.01)。HP 阳性组 IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-y、IL-21的表达与HP阴性组和对照组相比无统计学差异(p>0.05)。3.Westem-blot检测显示HP 阳性组较HP阴性组及对照组自噬标志性蛋白LC3表达水平明显降低,而P62表达水平明显增高;自噬相关蛋白Beclin-1、Atg5、Atg16L1表达量较HP阴性组及对照组均有不同程度的降低;磷酸化Akt蛋白水平较HP阴性组及对照组降低,而磷酸化的mTOR水平增高。结论:1.HP感染显著影响胃黏膜微生物群,降低了胃黏膜微生物群多种分类水平的丰度。与HP阴性组相比,HP感染对胃黏膜微生物群的影响更大。2.IL-17A/FOXP3对调节性T细胞偏向反应的平衡有利于HP持续感染,导致慢性活动性胃炎。3.HP感染可能是通过PI3K/Akt/mTOR信号途径参与了对自噬的抑制作用。