蛋白质的乙酰化修饰是一种重要的、高度保守且可逆的蛋白质翻译后修饰,最初是在组蛋白中发现,它是由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)催化调控。组蛋白的乙酰化修饰是生物体生命活动中一种重要的调节方式,在真核生物的基因转录调控中发挥着关键作用。随着对组蛋白乙酰化的广泛研究深入,人们发现在组蛋白之外,非组蛋白也存在乙酰化修饰。前期研究中,本课题组通过nano-HPLC/MS/MS技术鉴定了家蚕的营养储藏类蛋白中有大量的乙酰化修饰位点,同时发现乙酰化修饰可以调控多个家蚕的营养储藏类蛋白的稳定性,其中包括SP2、Bm Apo Lp-II、Bm Apo Lp-III和Bm30K-3等。本论文基于前期基础,开展乙酰化修饰对家蚕SP1(Storage protein 1)蛋白稳定性机制的研究,进一步证实乙酰化修饰调控参与家蚕营养储藏与利用的机制。首先进行家蚕SP1蛋白表达、抗体制备和乙酰化修饰鉴定。以提取的家蚕总RNA为模板,利用逆转录PCR技术扩增出家蚕SP1的ORF片段,酶切回收产物分别连接到原核表达载体p ET-28a(+)、真核表达载体p IEx-1-GFP上,构建原核表达载体p ET-28a(+)-SP1和真核表达载体p IEx-1-GFP-SP1。将鉴定正确的p ET-28a(+)-SP1菌液进行培养并诱导蛋白表达,重组蛋白纯化后通过免疫注射大白兔获得家蚕SP1蛋白的多克隆抗体,通过ELISA和Western Blotting检测制备的家蚕SP1蛋白兔多克隆抗体效价在1:16000以上,且具有较高特异性。另外,将真核表达载体p IEx-1-GFP-SP1转染进家蚕Bm N细胞,转染48 h后收取蛋白样品,用6×His抗体检测家蚕SP1蛋白成功表达;通过6×His单抗免疫共沉淀获得融合表达SP1蛋白,泛乙酰化抗体WB检测表明家蚕SP1蛋白具有较高的乙酰化水平。其次开展乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白表达影响研究。用去乙酰化酶抑制剂Cocktail和乙酰化酶抑制剂C646、A485分别处理转染了p IEx-1-GFP-SP1质粒的Bm N细胞。结果发现,当用去乙酰化酶抑制剂Cocktail上调蛋白乙酰化,与共表达的GFP蛋白相比,家蚕SP1蛋白的表达水平随Cocktail剂量的增加呈现明显的上升趋势,与之相反,用乙酰化酶抑制剂C646、A485下调蛋白乙酰化水平,则会降低家蚕SP1蛋白的表达水平,并且与药物用量呈现一种负相关关系。同时,用制备的家蚕SP1兔多克隆抗体检测Cocktail、C646、A485处理对家蚕Bm N细胞内源性SP1蛋白表达的影响,其结果与过表达SP1蛋白的趋势一致,表明乙酰化水平的上调或下调进而可以提高或降低家蚕SP1蛋白的表达水平和细胞含量,通过RT-q PCR技术检测发现,经Cocktail、C646、A485处理细胞后,SP1基因的转录水平并无发生明显改变,表明乙酰化修饰在翻译后修饰水平上调家蚕SP1蛋白的表达和细胞含量。最后开展乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白稳定性影响及其机制研究。用蛋白合成抑制剂CHX和蛋白酶体抑制剂MG132分别处理Bm N细胞,同时Cocktail处理研究乙酰化修饰对家蚕SP1蛋白胞内降解与累积的影响。与对照组相比,发现CHX阻断蛋白合成途径时,Cocktail处理后家蚕SP1蛋白的降解曲线较为平缓,并呈一定的上升趋势;而用MG132阻断蛋白酶体降解途径后,经Cocktail处理的家蚕SP1蛋白含量明显高于对照组,表明在上调乙酰化水平后,家蚕SP1蛋白胞内稳定性得以提升,和蛋白酶体降解途径有关。为了研究乙酰化修饰提升家蚕SP1蛋白稳定性的作用机制,将家蚕泛素蛋白与SP1蛋白的过表达载体共转染分别用Cocktail、C646和A485处理的家蚕Bm N细胞,通过免疫共沉淀方法获得真核表达的His-SP1融合蛋白,WB检测结果显示,用Cocktail处理后蛋白的泛素化水平呈下调趋势,而用C646、A485处理后蛋白的泛素化水平呈明显上调趋势,说明家蚕SP1蛋白乙酰化水平的上调可以导致泛素化水平的下调,表明家蚕SP1蛋白的乙酰化修饰与其泛素化存在竞争。综合上述结果表明,家蚕SP1蛋白乙酰化修饰通过竞争其泛素化修饰,抑制泛素化修饰介导的蛋白酶体降解途径,进而提高SP1蛋白在细胞中的稳定性和累积。以上结果进一步表明乙酰化修饰通过调控家蚕营养储藏蛋白的稳定性来调节家蚕的营养储存和利用,有望发现家蚕中一种新的营养储藏和利用的调控机制。