烟草是一种重要的经济作物,因其烟叶中富含多酚、茄尼醇、烟碱等多种有益成分而具有重要的医药价值。其中茄尼醇是一些重要药物的中间体,可用于合成辅酶Q10和维生素K2等泛醌类药物和抗癌增效剂SDB。目前,医药上利用的茄尼醇主要来源于废弃烟叶,因此对烟草茄尼醇的生物合成进行研究,对茄尼醇含量的调控具有重要的意义。本研究利用超高效液相色谱和实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法,测定了茄尼醇含量差异显著的烟草品种红花大金元(含量高)和中烟90(含量低)6个发育时期根、茎、叶中茄尼醇含量以及萜类代谢关键酶基因的表达,分析了茄尼醇积累与各关键酶基因表达的相关性。另外,通过克隆得到了烟草茄尼基焦磷酸合酶的基因,并对基因序列进行了生物信息学分析,最后通过构建过表达载体,对该基因的功能进行了研究。主要的研究结果如下:(1)茄尼醇在红花大金元和中烟90的6个取样时期茄尼醇含量:叶>茎>根。两品种中7种萜类关键酶基因表达模式不尽相同,FPS、DXR、IPI、SPS、GGPPS基因的表达从苗期至开花期表达量逐渐上升,在根中至现蕾期表达量最高,在茎、叶中开花期最高,随后迅速下降。相关性分析表明,DXS、GGPPS与茄尼醇含量呈负相关,而FPS、DXR、SPS以及IPI基因的表达量与茄尼醇含量呈显著和极显著正相关。另外,根、茎中IPI基因与DXS、FPS、SPS基因的表达呈显著和极显著正相关;叶片中SPS与FPS、IPI基因的表达呈显著正相关,而与DXS基因的表达呈显著负相关,HMGR与IPI基因表达呈极显著正相关。(2)克隆获得了2个SPS基因,分别命名为NtSPS1和NtSPS2,基因全长为1209、1248bp,分别编码402和416个氨基酸,2个基因编码的蛋白质均属于亲水性蛋白质,无跨膜结构,分别定为与叶绿体和线粒体,两基因均包括2个保守的DDxxD功能结构域。另外,NtSPS1编码的蛋白质不稳定指数较高,属于不稳定蛋白质,NtSPS2编码的蛋白质不稳定指数较低,属于稳定蛋白质。(3)构建了NtSPS1和NtSPS2的过表达载体,并利用农杆菌介导的方法分别获得了16和8个转基因植株。荧光定量PCR结果表明,NtSPS1阳性植株的表达量是非转基因植株的6-15倍,SPS1转基因表达量是NtSPS2转基因表达量的3-5倍,转基因植株烟叶茄尼醇含量比对照增加20-30%。