牦牛作为青藏高原上的特有物种,对农牧民具有重要的经济价值,但其因为自然繁殖率低,体外受精（IVF）无疑成为解决这一问题的主要手段。然而,牦牛卵母细胞的质量是成功受精以及影响胚胎发育的关键因素。黄曲霉素B1（AFB1）作为饲料中最危险的霉菌毒素,对饲料的污染无法完全避免,且污染后高度稳定。误食因AFB1污染的饲料会导致哺乳动物的生殖毒性,破坏卵母细胞表观遗传修饰和质量,并影响受精。因此,预防和缓解因AFB1诱导的毒性最有效的方法是补充药物或抗氧化剂。抗坏血酸（AA）作为一种抗氧化剂被广泛的应用于细胞培养,并且已被证实是DNA甲基化调节中TET双加氧酶不可替代的辅助因子。然而,AA对牦牛IVF胚胎DNA甲基化调控的作用以及是否能够保护牦牛卵母细胞免受AFB1的毒性影响仍然未知。本实验通过DNA甲基化评估了AA对牦牛植入前胚胎的发育影响,以及AA对暴露在AFB1中卵母细胞的保护作用,旨在阐明其可能发生的具体机制。1.添加不同浓度的AA培养IVF胚胎,统计卵裂率和囊胚率以及通过凋亡染色（TUNEL）评估囊胚凋亡率和囊胚细胞数。结果显示,与对照组相比,添加50μg/mL AA显著增加了囊胚细胞数,降低了促凋亡基因BAX表达的同时增加了抑调亡基因BCL-2的表达,并且抑制囊胚的凋亡率。其它浓度的AA（100、200μg/mL）对这些指标均产生了不良的影响。因此,选用50μg/mL AA进行后续实验。2.通过第一极体率、精卵结合能力、孤雌激活胚胎发育率、ROS水平、早期凋亡、线粒体分布和肌动蛋白丝完整性七个指标评估AFB1对卵母细胞的毒性影响以及AA的保护作用。结果显示,首先,AFB1的暴露不利于卵母细胞的减数分裂成熟,阻碍卵母细胞第一极体率,降低精卵结合能力和孤雌激活胚胎发育率,导致成熟卵母细胞的质量下降。其次,AFB1的毒性对肌动蛋白丝的完整性具有破坏作用。最后,AFB1对卵母细胞产生了氧化应激损伤,干扰线粒体均匀分布,促进卵母细胞的早期凋亡。添加50μg/mL AA之后,这些指标可恢复到与对照组接近的水平,表明AA可以保护卵母细胞免受AFB1的毒性影响。此外,通过DNA甲基化免疫荧光（5mC）和甲基化转移酶（DNMT1、DNMT3b、DNMT3b）的检测发现,与对照组相比,AFB1对成熟卵母细胞的毒性影响改变了DNA甲基化的水平,添加50μg/mL AA可以显著改善成熟卵母细胞的DNA甲基化水平。3.利用免疫荧光染色法和荧光定量PCR对IVF胚胎发育各阶段DNA甲基化的动态表达（5mC、5hmC、TET3）以及相关甲基化基因（DNMT1、DNMT3b、DNMT3b、TET3）进行检测。荧光染色结果显示,牦牛植入前胚胎仍然遵循DNA去甲基化和再次甲基化的经典模式,而再次甲基化发生在囊胚阶段。其次,TET3在细胞质中的独特表达对去甲基化机制起到关键作用。与对照组相比,添加50μg/mL AA增强了胚胎各阶段5mC,5hmC的荧光信号强度,改变了甲基化转移酶DNMT1和DNMT3a的表达水平,但没有改变甲基化转移酶DNMT3b的表达水平。与对照组相比,添加50μg/mL AA显著增强了TET3在2细胞、4细胞、8细胞和桑葚胚阶段的荧光信号强度,而囊胚阶段的信号强度显著降低,荧光信号强度趋势与自身的mRNA转录丰度相似。4.利用甲基化测序和荧光定量PCR对囊胚阶段多能性基因（CDX2、POU5F1、SOX2、NANOG）进行检测。结果显示,在牦牛IVF囊胚阶段多能性基因CDX2启动子区域呈低甲基化水平,而多能性基因SOX2、POU5F1和NANOG启动子区域呈中等甲基化水平。与对照组相比,添加50μg/mL AA降低了多能性基因NANOG启动子区域的甲基化水平,但没有改变其他多能性基因启动子区域的甲基化水平。荧光定量结果显示,与对照组相比,添加50μg/mL AA增加了多能性基因CDX2、POU5F1和NANOG的表达量,但对多能性基因SOX2的表达没有产生显著影响。以上研究结果表明,抗坏血酸可以保护牦牛卵母细胞免受黄曲霉素B1暴露引起的质量下降和DNA甲基化异常,从而有助于调节牦牛植入前胚胎的DNA甲基化,增加囊胚细胞数。