背景与目的髓母细胞瘤(Medulloblastoma,MB)和胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GB)分别是好发于儿童和成人的原发性颅内恶性肿瘤。由于它们在颅内呈侵袭性生长,手术难以根除,术后极易复发,故预后甚差。大量的临床资料表明,MB的发病率虽低于白血病,但死亡率却居儿童恶性肿瘤的首位,其对常规放、化疗不敏感,而大剂量的冲击疗法又使患儿难以忍受,即便少数病例经过多方治疗之后得以存活,也经常出现智力发育障碍和在青壮年期间罹患继发性肿瘤以及诸如多囊肾、肺纤维化和发育畸形等多种后遗症。同样,作为星形细胞肿瘤中恶性程度最高的多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme,GM)即使在手术后接受放射和化学等辅助性治疗,患者一般也只能存活12-15个月,最后死于肿瘤复发。迄今为止,国内外还没有针对这两种原发性脑肿瘤的可靠的辅助性治疗手段。因此,寻求更为有效且无明显毒副作用的MB和GB治疗措施具有明显的学术价值和现实的肿瘤治疗学意义。以往的研究表明,临床常用的肿瘤细胞分化诱导剂全反式维甲酸(Retinoic acid,RA)虽可诱导髓母细胞瘤细胞系(Med-3)发生分化,但并不能诱导细胞凋亡,且其作用具有明显的可逆性；因此,需要与常规化疗药物如顺铂(DDP)配伍使用才能诱导髓母细胞瘤细胞发生凋亡。我们的近期研究发现,不同髓母细胞瘤细胞系对RA的敏感性有很大不同,其主要原因是细胞内维甲酸结合蛋白-Ⅱ／CRABP-Ⅱ在约60%左右的临床病例中由于DNA甲基化而表达下调甚至沉默,从而影响了RA抗肿瘤信号向胞核内传递。而对于胶质母细胞瘤,单纯RA处理很难抑制其增殖并诱导其死亡,所以需要与其他化学或免疫制剂如INF-γ联用才能达到上述目的。这无疑加大了治疗的毒副作用和对患者的损伤。可见,探索更为安全有效的抗MB和GB药物并阐明其在细胞内的代谢活性形式和抗癌作用的分子机制已成为改善原发性脑恶性肿瘤临床治疗现状的当务之急。白藜芦醇(Resveratrol, Res)是广泛存在于天然植物如葡萄、草莓、花生中的多酚类次生代谢产物,具有抗心血管疾病、抗突变、抗炎、抗氧化和防治肿瘤等有益的生物药理学活性,并对机体没有毒副作用且能通过血脑屏障。因此,该化合物在防治癌症方面具有独特的药用价值,同时也提示它更适合治疗颅内恶性肿瘤尤其是儿童期脑肿瘤。为此,我门使用白藜芦醇首先对5个不同分化程度的髓母细胞瘤细胞系做了系统的观察。结果显示,白藜芦醇以剂量和时间相关性的方式抑制髓母细胞瘤细胞生长,诱导被处理细胞出现神经元样的表型并死于凋亡；我们还发现,白藜芦醇能上调CYP1A1和下调CYP1B1表达,引起Wnt、Notch和Stat3等信号通路活化状态以及它们下游靶基因表达形式的改变；另外,白藜芦醇能使髓母细胞瘤细胞阻滞在S期并明显下调c-Myc、Survivin和cyclin D1表达。由此可见,白藜芦醇有可能成为临床治疗髓母细胞瘤的理想候选药物。相比之下,胶质母细胞瘤细胞对白藜芦醇的反应却不尽相同,有些敏感如U251细胞系,而更多的则不敏感甚至耐受。故深入探讨导致这种差异发生的内在机制将有助于阐明白藜芦醇治疗胶质母细胞瘤的药用价值,同时为肿瘤个性化治疗的提供理论依据。尽管白藜芦醇的临床应用价值日趋引起人们的关注,但对白藜芦醇在机体或细胞内的代谢产物活性形式的确定、代谢产物与机体或细胞之间相互作用的机制以及有效代谢产物形成的酶学基础等研究至今仍少见报道,且目前尚无商品化的白藜芦醇代谢物标准品,这些都将成为阻碍白藜芦醇合理用药的瓶颈。目前,在白藜芦醇敏感型细胞内鉴定其有效代谢产物的研究仍十分罕见,而在中枢神经系统肿瘤的研究迄今尚未见报道。可见,开展该领域研究是实现白藜芦醇肿瘤个性化治疗的关键所在,具有明显的转化肿瘤学意义。鉴于此,本课题将利用髓母细胞瘤细胞系UW228-3和胶质母细胞瘤细胞系LN-18这两个成熟可靠的对白藜芦醇敏感程度迥异的体外实验模型,围绕以下内容展开系统的研究：1)通过高效液相色谱(HPLC)、液质联用技术(LC/MS/MS)及高分辨质谱(HRMS)对白藜芦醇在髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞内的代谢产物进行鉴定；2)采用多种分子生物学技术对与代谢产物相关的代谢酶进行分析,以阐明影响药物作用的相关酶的活性状态及表达情况；3)比较白藜芦醇在敏感程度迥异的肿瘤细胞间可能存在的代谢差异,阐明与白藜芦醇抗癌活性密切相关的代谢产物和代谢酶及其亚型和4)探究白藜芦醇处理前后髓母细胞瘤UW228-3和胶质母细胞瘤LN-1 8细胞系中STAT3信号通路活化状态的改变,并进一步分析STAT3上、下游相关基因的表达情况。从而为白藜芦醇抗癌谱之判定和癌症个性化治疗提供科学而可靠的指标。材料与方法髓母细胞瘤及瘤旁相对正常小脑组织由大连医科大学第一附属医院病理科和中国医科大学盛京医院病理科提供。实验所用人髓母细胞瘤细胞系UW228-3由华盛顿大学(西雅图)神经肿瘤学实验室提供；胶质母细胞瘤细胞系LN-18由瑞士洛桑大学医学院(CHUV)神经外科实验室提供。Wistar大鼠由大连医科大学实验动物中心提供。人髓母细胞瘤UW228-3细胞培养于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,用100gM白藜芦醇处理细胞后,分别收集细胞及培养液；经固相萃取(SPE)纯化后,通过HPLC、LC/MS/MS及高分辨质谱(HRMS)技术,对白藜芦醇在髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞中的主要代谢产物及代谢特点进行分析和比较；基于代谢产物的类型,推测出相关代谢酶,利用石蜡组织微阵列技术及免疫组织化学染色(IHC)检测硫酸酯转移酶SULT1A1,1C2和4A 1在人髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤中的表达情况,并通过与瘤旁组织及正常鼠脑组织比较(注：由于不可能获取新鲜正常人大脑和小脑组织,故在符合实验动物伦理学原则的情况下,将相应的大鼠脑组织作为正常对照),分析相关代谢酶在正常组织与肿瘤组织中的表达特点；通过流式细胞仪、MTT检测及台盼蓝计数分析不同培养条件下髓母细胞瘤细胞和胶质母细胞瘤细胞对白藜芦醇的敏感程度的变化；采用免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光、RT-PCR及Western蛋白印迹分析等方法,检测白藜芦醇处理前后髓母细胞瘤细胞系和胶质母细胞瘤细胞系中相关代谢酶的表达水平及STAT3信号通路活化状态的改变,分析探讨相关靶基因的表达特点。实验数据采用SPSS11.5软件包应用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney检验方法进行统计分析。结果一、白藜芦醇对髓母细胞瘤UW228-3细胞的作用及其代谢特点1.白藜芦醇能促进髓母细胞瘤UW228-3细胞分化并诱导其凋亡,抑制其生长HE及ICC染色结果显示,正常培养的UW228-3细胞呈饱满的梭形,未见突触素表达；经100μM白藜芦醇处理48h后,细胞呈现神经元状的分化表型,细胞中突触素呈阳性表达；流式细胞仪检测的结果显示,UW228-3细胞经100μM白藜芦醇处理后发生G1期阻滞；相应的胎盘蓝染色计数结果表明,UW228-3细胞的染色比例与白藜芦醇作用时间正相关。2.髓母细胞瘤UW228-3细胞中的白藜芦醇主要代谢产物为单硫酸酯白藜芦醇在UW228-3细胞中代谢产物经HPLC及LC-MS/MS分析,所得TIC图谱对应的3个色谱峰分别为：M1,反式白藜芦醇,m／z 226.9、m／z 184.9和m／z 1 42.9；M2,顺式白藜芦醇,m/z 226.7、m/z 184.8和m／z 142.9；M3,白藜芦醇单硫酸酯,m/z 307.1、m/z 227.0、m/z 184.9和m／z 143.0。代谢产物进一步通过高分辨质谱(HRMS,阴离子模式)分析得到精确分子质量227.0698(C14H11O3,理论值m／z 227.0708),227.0697(C1 4H11O3,理论值m／z 227.0708)和307.0261(C14H11S06,理论值m／z 307.0276),进一步验证白藜芦醇在UW228-3中代谢产物的类型。其中白藜芦醇不稳定,在自然光下即可产生其异构体顺式白藜芦醇,故M2不是真正意义上的代谢产物。3.白藜芦醇相关代谢酶SULT 1A1,1C2和4A1在髓母细胞瘤组织中表达水平较瘤旁脑组织及大鼠正常脑组织表达水平低免疫组织化学染色及Western-blotting结果显示,白藜芦醇相关代谢酶硫酸酯转移酶SULT 1A1,1C2和4A 1在正常脑组织及髓母细胞瘤中均有表达,但SULT 1A1和4A1在肿瘤组织中表达水平与瘤旁组织及大鼠正常小脑组织的表达水平相比有显著性差异(P<0.01); SULT 1C2在髓母细胞瘤患者肿瘤组织表达水平与大鼠正常小脑组织比较有显著性差异(P<0.01),而与瘤旁组织表达水平相比差异不显著(P>0.05)。4.白藜芦醇虽上调髓母细胞瘤UW228-3细胞硫酸酯转移酶SULT1 A1,1 C2和4A 1表达但总体水平仍低于正常大鼠小脑组织的表达水平RT-PCR及Western-blotting结果显示,SULT 1C2和4A1在正常培养的UW228-3细胞内表达较低,经1 00μM白藜芦醇处理后其表达水平明显升高,但仍低于正常水平；相对而言,SULT 1A1在正常培养的UW228-3细胞内表达较高,经白藜芦醇处理后表达水平有所升高,但略低于正常组织水平。上述结果在ICC中进一步得到验证。5.白藜芦醇生物转化产物的抗肿瘤活性低于反式白藜芦醇利用自然光照射产生的顺式白藜芦醇／白藜芦醇混合物及体外生物转化白藜芦醇单硫酸酯／白藜芦醇混合物(HPLC分析含量均大于50%)分别处理UW228-3细胞,HE及胎盘蓝计数结果显示,UW228-3细胞既无明显的神经元样分化表型,也无明显的细胞凋亡和生长抑现象。二、白藜芦醇在胶质母细胞瘤LN-18中的代谢特点1.白藜芦醇处理后的胶质母细胞瘤LN-18细胞无生长抑制和凋亡征象HE及TUNEL染色结果显示,正常培养的LN-1 8细胞呈椭圆形,100gM白藜芦醇处理48小时后,细胞形态未出现明显的改变,也无明显凋亡；流式细胞仪检测的结果显示,LN-18细胞被白藜芦醇阻滞于G1期；胎盘蓝染色计数结果表明,LN-18细胞的染色比例与白藜芦醇作用时间无明显相关性。2.白藜芦醇在胶质母细胞瘤LN-18细胞中代谢产物也为白藜芦醇单硫酸酯HPLC、LC/MS/MS及HRMS的结果显示,白藜芦醇在胶质母细胞瘤LN-18细胞中代谢形式与髓母细胞瘤UW228-3基本相似,即以白藜芦醇单硫酸酯为主。3.白藜芦醇能够上调胶质母细胞瘤LN-18细胞中硫酸酯转移酶SULT1A1、1C2和4A1的表达水平,上调水平较髓母细胞瘤UW228-3细胞更为明显,但其表达水平仍低于正常大鼠小脑组织表达水平RT-PCR、Western-blotting及ICC结果显示,胶质母细胞瘤LN-18细胞中除SULT 1A1表达水平较高,SULT 1C2和4A1均呈弱表达；白藜芦醇处理后,SULT 1A1,1C2和4A 1的表达水平均有上调,但SULT4A1的表达依然很弱,而SULT1A1的表达接近正常大鼠小脑组织表达水平。三、STAT3信号通路在髓母细胞瘤及胶质母细胞瘤中的作用及意义1.白藜芦醇能够抑制髓母细胞瘤UW228-3细胞中STAT3的转录和活化,并改变STAT3上游和下游基因的表达,促进UW228-3细胞分化和凋亡RT-PCR及ICC结果显示,STAT3在正常培养的UW228-3细胞的核及浆中均有表达,但经100μM白藜芦醇处理后,STAT3的表达明显下调(P<0.01),在细胞核中几乎检测不到P-STAT3表达；STAT3下游基因如c-Myc、Survivin、Cox-2及cyclin D1经白藜芦醇处理后,表达明显降低,但Bcl-2呈上调趋势；白藜芦醇能够促进STAT3上游基因LIF的表达和分泌；免疫荧光(IF)及ICC结果显示,PIAS3(Protein inhibitor of activated STAT3,活化的STAT3蛋白抑制剂)正常培养的UW228-3细胞中,主要分布于胞浆中,白藜芦醇处理后出现明显的核易位现象,胞浆和胞核均呈阳性表达。2.不同于敏感的髓母细胞瘤UW228-3细胞,白藜芦醇不抑制胶质母细胞瘤LN-18细胞中STAT3的转录和活化,对STAT3上、下游基因的表达均无显著影响RT-PCR及Western-blotting结果显示,白藜芦醇处理前后胶质母细胞瘤LN-18细胞中STAT3.p-STAT3及其下游基因c-Myc.Survivin. Cox-2.cyclin D1及Bcl-2的表达无显著性变化(P>0.05):ICC及Western-blotting结果提示,白藜芦醇同样能够促进LN-18细胞中LIF的表达和分泌；ICC及IF结果显示,正常培养条件下,PIAS3在LN-18细胞胞浆中呈弱阳性表达,经白藜芦醇处理后,LN-18细胞胞浆PIAS3表达增强,但胞核依旧呈阴性表达,PIAS3未出现明显核易位现象。三、STAT3磷酸化抑制剂AG490能够阻断髓母细胞瘤UW228-3及胶质母细胞瘤LN-18中STAT3信号通路,抑制其下游靶基因的转录和活化,60μM AG490能够有效抑制UW228-3和LN-18细胞生长并诱导其凋亡。RT-PCR及ICC结果显示,AG490同时下调c-Myc,Cox-2,cyclin D 1及survivin的表达。结论一、白藜芦醇以剂量相关的方式诱导髓母细胞瘤UW228-3细胞的分化和凋亡；但胶质母细胞瘤LN-18细胞对其却不敏感；二、白藜芦醇在敏感的髓母细胞瘤和耐受的胶质母细胞瘤细胞中的代谢形式基本相同,其代谢产物主要为白藜芦醇单硫酸酯；三、白藜芦醇作用于UW228-3细胞后10min内即可检测到其代谢产物白藜芦醇单硫酸酯,并于12小时达到峰值,这提示代谢过程先于凋亡现象；四、硫酸酯转移酶SULT 1A1.1 C2和4A 1主要分布于人和哺乳动物脑中,它在髓母细胞瘤组织中的总体水平要低于瘤旁组织和正常鼠脑组织；五、白藜芦醇能上调髓母细胞瘤和胶质母细胞瘤细胞中SULT1A1、1 C2和4A 1的表达水平,但表达的总体水平仍低于正常大鼠小脑组织表达水平；六、白藜芦醇具有化学不稳定性,在自然光下即可转化为其异构体顺式白藜芦醇并导致抗肿瘤活性明显降低；七、白藜芦醇代谢为白藜芦醇单硫酸酯后,有助于白藜芦醇的胞外排出,从而降低了抗肿瘤效果；八、白藜芦醇能够有效地抑制髓母细胞瘤的STAT3信号通路并影响STAT3上下游基因的表达,诱导UW228-3细胞凋亡；相反,白藜芦醇对胶质母细胞瘤的STAT3信号通路无抑制作用,LN-18细胞经白藜芦醇处理后无明显凋亡指证。这提示,STAT3对白藜芦醇的反应性因肿瘤细胞的类型而异并与化学敏感性有关；九、STAT3磷酸化抑制剂AG490能够诱导髓母细胞瘤UW228-3和胶质母细胞瘤LN-18细胞分化和凋亡,同时下调c-Myc,Cox-2,cyclin D 1和survivin的表达水平,从而证明了我们的上述推论；十、肿瘤细胞SULT的总体水平和STAT3的活化程度与其白藜芦醇敏感性密切相关,可作为白藜芦醇选择性用药和个性化治疗的生物标记物。