抗重金属铜离子mAb的制备及ELISA检测方法的建立

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铜(Cu)在日常生活中应用非常广泛,是人类和动植物体内必需的微量元素,但是过量的铜也会给机体带来很大的危害。针对重金属的理化检测方法存在费用高、样品前处理繁琐、不能现场快速检测等缺点,其推广应用受到了局限。本论文利用免疫学技术旨在制备出抗Cu2+-EDTA单克隆抗体并建立铜离子阻断ELISA检测方法。  将铜离子与双功能螯合剂 ITCBE螯合,形成半抗原,采用异硫氰酯法将其与载体蛋白(BSA、OVA)偶联,获得免疫原Cu2+-ITCBE-BSA和包被原Cu2+-ITCBE-OVA,用UV、ICP-AES、SDS-PAGE等进行鉴定,并通过免疫动物获得的Cu2+-EDTA pAb进行鉴定,以确定免疫原是否合成成功。结果表明,免疫原和包被原蛋白浓度分别为9.21 mg/mL和6.25 mg/mL,Cu2+质量浓度分别为16.83μg/mL和6.42μg/mL;分子量大于BSA;pAb效价达到了1∶(5.12×104),对Cu2+-EDTA的半数抑制浓度(IC50)为29.92 ng/mL,与 Zn2+-EDTA的交叉反应率(CR%)为27.01%,与其他重金属螯合物无交叉反应。  采用免疫原Cu2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠,通过间接ELISA和阻断ELISA法筛选细胞融合备用小鼠,利用细胞融合技术制备抗Cu2+-EDTA单克隆抗体。结果表明,筛选出4株杂交瘤细胞株,分别命名为1F7、2B8、3G5和3D10。其中2B8株细胞培养上清中的抗体效价为1∶(1.28×103),腹水抗体效价为1∶(5.12×105),同种型为IgG1/κ型,亲和常数(Ka)为7.87×1011 L/moL,IC50为29.78 ng/mL,与Zn2+-EDTA的CR%为26%,与其他重金属螯合物没有交叉反应。  采用2B8细胞株产生的腹水单抗组装 Cu2+阻断 ELISA检测试剂盒,并利用阻断ELISA法测其灵敏度、添加回收试验测其准确度、批内批间试验测其精密度、交叉反应试验测其特异性。结果表明,试剂盒灵敏度为11.91 ng/mL;添加回收试验和批内批间试验的变异系数均小于15%;除与Zn2+-EDTA的CR%为26%外,与其他重金属螯合物无交叉反应;4℃能保存六个月。  本论文成功制备了抗Cu2+-EDTA的人工抗原,筛选出一株特异、敏感、高效价的单克隆细胞株,建立了敏感、特异的铜离子阻断ELISA检测方法。
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