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盐,旱等非生物胁迫减少世界范围内庄稼的产量。增加对不同环境胁迫的抗性是遗传改良植物性状的目标。大量胁迫应答基因被用来做转基因抗逆的研究,但是还没有磷酸肌醇(PI)途径中的肌醇磷酸激酶基因被用来转基因产生广谱胁迫耐受性的植株。先前有报道已经克隆到了拟南芥的肌醇磷酸6-/3-激酶基因(AtIpk2β),拟南芥中AtIpk2β可以通过生长素信号通路调节腋芽分支,过表达AtIpk2β的拟南芥植株腋芽分支明显增多(Zhang et al,2007),可是它在植物中的其它生理学角色还不清楚。
在酵母中,ARG82/IPK2基因编码一个肌醇多磷酸激酶,这个激酶可以将IP3磷酸化成IP4(肌醇1,4,5,6-四磷酸)和IP5(肌醇1,3,4,5,6-五磷酸)(Odom et al,2000;Saiardi et al,2000)。酵母的arg82/Ipk2突变体(arg82△)缺乏Ipk2的活性,导致它在30℃的条件下减慢生长,在37℃的条件下生长进一步的受到抑制。
为了阐明是否AtIpk2β在盐和渗透胁迫条件下互补突变体的表型,本研究克隆了AtIpk2β的开放读码框到酵母表达载体pYX212中,然后将构建好的酵母表达载体pYX212-AtIpk2β转化到突变体中。研究证明了拟南芥AtIpk2β在酵母arg82/Ipk2突变体(缺乏Ipk2活性)中的组成表达恢复了突变体的正常生长,增加了它们在胁迫条件下的生存能力,并且恢复arg82A在37℃条件下的生长。
另外,通过实时定量RT-PCR和Western的方法分析了拟南芥AtIpk2β在盐、冷、旱、以及ABA胁迫条件下的表达水平,研究发现,该基因在转录和翻译时都受到各种胁迫的调节。结果表明AtIpk2β是胁迫应答的基因,在植物中很可能在不同的非生物胁迫和ABA介导的信号通路中发挥着作用。
异源表达AtIpk2β的转基因烟草提高了对不同胁迫的抗性。转基因烟草在幼苗期和成体植株在含有不同浓度NaCl的培养基质中的生长明显优于野生型植株。本研究也检测了缺水条件下植物的生长,控水21天后,野生型植株的萎蔫程度高于转基因株系。控水结束后,萎蔫的植物被重新灌溉并且生长产生种子。恢复后,转基因植物的高度比野生型有一定的增加。并且发现,在H2O2诱导的叶绿素丧失的研究中,转基因植株叶片的叶绿素丧失的程度明显低于野生型植株。经过H2O2处理后,转基因烟草植物中CAT的活性也显著提高。经过短期的低温胁迫后,转基因幼苗的成活率也显著高于野生型植株,表明了转基因植物较好的抗冻能力。本研究猜测抗众多胁迫的能力有可能通过抗氧化能力的提高而得以提高,维持植物在各种胁迫条件下较好的生长、繁殖。
IP3诱导细胞内钙的释放,IP3是IP3K的直接底物。检测了植物幼苗根和根毛中钙的分布。钙成像的结果表明,AtIpk2β异源表达的转基因植物中,在根和根毛区钙离子的浓度都比野生型的含量低。表明转基因植物降低了细胞内钙的释放。这和IP3K将IP3转化成IP4,降低了IP3的含量,从而降低了细胞内钙的释放是一致的。
大量的应答非生物胁迫的胁迫诱导基因已经被分离,在植物中作为监控胁迫应答的分子标记(Kalifa et al,2004;Kasuga et al,2004)。AtIpk2β异源表达的植株的胁迫耐受性分析表明,AtIpk2β在植物中可能调节多胁迫应答。为了明确AtIpk2β是否在胁迫基因的转录调节中扮演着重要的角色,本研究通过RT-PCR的方法检测了5个胁迫相关基因的转录水平。在正常和盐胁迫条件下,在AtIpk2β异源表达的转基因植株中大部分胁迫基因的表达水平都比野生型高。因此,AtIpk2β很可能参与不同胁迫调节基因的表达调节。这些结果表明,单一调节AtIpk2β(肌醇磷酸信号转导通路的基因)的活性很可能是植物遗传育种提高各种环境胁迫的耐受性的一种有效的方法。