多溴联苯醚(PBDEs)作为一种阻燃剂被广泛应用于商业和家庭用品等各个领域。然而,PBDEs化学性质稳定、不易降解、且具有生物蓄积性,能够长期存在于环境和生物体中,对人类生存环境和生命健康造成极大的威胁。在生物体内,PBDEs可能发生生物转化,产生相应的羟基代谢物(OH-PBDEs),进一步还可氧化生成多溴联苯醌(PBDEQ),这些代谢物与母体相比具有相似或更高的毒性。多溴联苯醌(PBDEQ)作为PBDEs的醌类代谢产物,在生物体内很容易与DNA、蛋白质、亲核试剂发生迈克尔加成反应。此外,PBDEQ在与对苯二酚-半醌-醌的氧化还原过程中还能产生半醌自由基或活性氧(ROS),引起氧化应激反应,进一步诱导细胞毒性,对生物体造成神经毒性、免疫毒性、生殖毒性以及致癌等作用。第一部分:该部分旨在研究PBDEQ能诱导小胶质细胞(BV2)发生细胞自噬。首先,我们检测了PBDEQ在不同浓度和不同时间作用下的细胞毒性,通过CCK-8实验发现PBDEQ引起BV2细胞存活率呈浓度和时间依赖性降低。接着,我们考察了PBDEQ是否能够引起细胞自噬。利用Western Blot实验检测了细胞自噬相关蛋白LC3B、p62的表达,结果显示PBDEQ暴露后LC3B-I向LC3B-II的转化增多,p62表达下调;通过免疫荧光实验检测LC3B在细胞内的表达,发现PBDEQ处理的细胞内有明显LC3B荧光斑点聚集的情况。以上结果初步推断PBDEQ能诱导BV2细胞发生自噬。同时,我们通过MDC染色和AO染色法检测自噬体形成情况,发现细胞内荧光强度明显升高,证实了PBDEQ能够诱导细胞自噬体的形成。但PBDEQ诱导的p62下调这一结果促使我们更进一步去研究自噬流是否通畅。接下来,我们采用自噬抑制剂3-MA和CQ,以及通过转染小干扰RNA(ATG5 siRNA)的手段来分析PBDEQ作用后LC3B在蛋白水平的表达,以此来判断自噬流是否通畅的情况。结果发现3-MA、转染ATG5 siRNA与PBDEQ共处理后,与单独PBDEQ暴露组相比,LC3B的蛋白表达水平均有所增加,而CQ处理后,LC3B的蛋白表达水平则下调,初步证明PBDEQ刺激BV2细胞引起的自噬流是通畅的。进一步表明PBDEQ引起的自噬流是通畅且顺利的。随后,我们通过转染GFP-LC3B质粒和免疫荧光实验考察了PBDEQ作用后自噬体与溶酶体融合情况。结果显示,与对照组相比,PBDEQ暴露后自噬体和溶酶体共定位明显增多,证明PBDEQ促进了细胞自噬体与溶酶体的融合。最后,为了阐明自噬在PBDEQ诱导的细胞毒性中的作用,我们通过CCK-8实验发现加入自噬抑制剂3-MA和CQ,以及转染ATG5 siRNA后加重了PBDEQ引起的细胞毒性。综上,PBDEQ诱导BV2细胞发生细胞自噬,并且自噬过程是通畅的,还进一步促进自噬体与溶酶体的融合。同时也证实了自噬在PBDEQ诱导的细胞毒性中起保护作用。第二部分:在上一章中,我们已经证明了PBDEQ能够诱导BV2细胞发生自噬,但是在机制方面未做深入的探究。在本章中,我们发现PBDEQ可以通过激活内质网应激途径来调控下游自噬的发生。首先,我们研究了PBDEQ对内质网稳态的影响。采用免疫荧光实验考察了内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP在细胞内的表达,结果显示两者在PBDEQ处理后表达水平均显著上升,初步说明PBDEQ能诱导细胞发生内质网应激。另外,我们还进一步通过检测细胞内钙释放情况证实内质网应激的激活。发现细胞内钙的释放随PBDEQ浓度增加而增加,再次说明PBDEQ能够激活内质网应激的发生。接着,我们探究了PBDEQ引起的内质网应激与自噬之间的关联。Western Blot实验证明PBDEQ激活了内质网应激相关的未折叠蛋白反应(UPR)的三条信号通路:PERK、IRE1α和ATF6。还发现PBDEQ通过依赖于PERK-e IF2α-ATF4-CHOP,ATF6通路从而诱导自噬发生。为了进一步证实细胞自噬是通过激活内质网应激而发生的,我们利用内质网应激抑制剂4-PBA抑制内质网应激后检测PBDEQ诱导细胞自噬的情况。通过Western Blot实验考察了4-PBA与PBDEQ共处理后自噬相关蛋白LC3B和p62的表达,结果发现抑制内质网应激后,LC3B-I向LC3B-II的转化减少,p62表达上调,说明抑制内质网应激能够抑制下游自噬水平。另外,我们还通过免疫荧光实验和MDC染色法检测了在4-PBA与PBDEQ共处理后自噬体的形成情况。结果显示抑制内质网应激后,LC3B荧光斑点聚集减少,且MDC荧光减弱,再次证明抑制内质网应激降低了细胞自噬活性。最后,我们发现活性氧抑制剂NAC能够明显抑制内质网应激和细胞自噬的发生,说明PBDEQ引起的内质网应激和细胞自噬受到ROS的调控。以上这些结果表明PBDEQ引起BV2细胞发生内质网应激,并通过激活PERK-eIF2α-ATF4-CHOP,ATF6通路调控自噬水平。同时,PBDEQ引起的内质网应激和细胞自噬与ROS水平有关。第三部分:在本章中,我们发现PBDEQ对BV2细胞具有DNA损伤毒性。首先,我们采用Western Blot实验分析了DNA损伤相关的蛋白质表达,发现γ-H2AX、p-ATM、p-ATR、Chk1、Chk2、p53和p21的表达随着PBDEQ浓度增加而上调。采用免疫荧光实验检测了PBDEQ刺激后DNA损伤蛋白γ-H2AX在细胞核的表达,结果显示在PBDEQ处理后γ-H2AX在细胞核表达明显增加。此外,我们还利用彗星实验考察了DNA损伤情况,发现PBDEQ组彗星拖尾明显加重。以上结果证明PBDEQ的暴露导致DNA损伤发生。但p53和p21上调这一结果促使我们更深入地去考察PBDEQ引起的DNA损伤是否通过细胞周期阻滞启动了修复机制。通过细胞周期试剂盒检测发现在PBDEQ刺激细胞后能够诱导细胞G2/M期阻滞。以上结果表明PBDEQ诱导DNA损伤毒性,并通过阻滞细胞周期来启动DNA损伤修复。接下来,我们考察了p53对PBDEQ引起的DNA损伤的影响。采用Western Blot实验发现在干扰p53后DNA损伤蛋白γ-H2AX表达上调,p21表达则下调,初步说明干扰p53会加重DNA损伤、减缓G2/M期阻滞。此外,我们还利用免疫荧光实验检测了在干扰p53后DNA损伤蛋白γ-H2AX表达的情况,结果显示γ-H2AX在细胞核荧光增强;还研究了在干扰p53后PBDEQ对细胞周期的影响,发现在干扰p53后细胞周期阻滞有所减缓。这些结果阐明了p53在PBDEQ所致的DNA损伤毒性中具有保护作用。最后,我们发现PBDEQ引起的DNA损伤与ROS有关,通过Western Blot实验检测了NAC处理后,PBDEQ引起DNA损伤相关蛋白表达下调,说明PBDEQ引起的DNA损伤受到ROS的调控。根据以上研究可知:PBDEQ引起BV2细胞DNA损伤毒性,同时启动细胞周期阻滞进行DNA损伤修复,并且该过程受到p53的调控。另外,PBDEQ诱导的DNA损伤与ROS的产生有关。