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研究背景:结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tb)感染引起的,目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。它被认为是一种慢性炎症性疾病,伴有巨噬细胞吞噬、杀伤结核菌过程贯穿其发生、发展的始终[1]。以往的研究表明[2],机体感染M.tb后,主要通过补体受体进入巨噬细胞,并通过干扰巨噬细胞吞噬和溶酶体成熟而长期寄生于宿主巨噬细胞内并造成潜伏感染。Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)介导天然免疫,与抗TB免疫反应相关。研究发现[3],Toll样受体4(Toll-likereceptor4,TLR4)在巨噬细胞抗M.tb的发生、发展中发挥着重要作用。有资料显示[4],非M.tb来源的TLR4受体激动剂LPS可通过TLR4途径和NOX2NADPH氧化酶及ROS信号通路促进THP-1巨噬细胞吞噬和杀伤M.tb。探讨LPS促进巨噬细胞吞噬及杀伤M.tb的机制,对于其作为免疫佐剂或潜在的临床抗结核预防用药,具有重要价值。目的:研究LPS对巨噬细胞氧依赖性杀伤结核分枝杆菌的促进作用,初步阐明其机制。方法:(1)结核分枝杆菌减毒株M.tbH37Ra用苏通氏液体培养基于细菌培养箱中培养1个月后接种至罗琴氏固体培养基,37°C培养1个月,无菌接种环收集M.tb菌体于1mL匀浆器中,加入生理盐水反复研磨,取细菌悬液,用生理盐水经10000rpm×2min洗涤3次,抗酸染色阳性且镜下观察细菌分散。分光光度计检测菌液浓度,用生理盐水配成浓度为5×106/mL的M.tb悬液,4°C备用。(2)10-100μg/mL浓度异硫氰酸荧光素(FITC),在磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)中标记M.tb,流式细胞术检测标记率和平均荧光强度(MFI)。FITC标记的M.tb以10∶1的比例感染巨噬细胞THP-1(A)18h-24h,以流式细胞术检测分析感染模型的感染率。(3)取FITC标记的M.tb与佛波醇酯(PMA)诱导分化的THP-1巨噬细胞(THP-1(A))共孵育1h-6h后,观察PMA活化的THP-1(A)细胞吞噬FITC标记M.tb的时间动力学变化。(4)0,100,1000ng/mL不同浓度LPS刺激THP-1(A)细胞24h后,与M.tb按不同比例(1:1-1:100)共培养30min,流式细胞术检测LPS对THP-1(A)细胞吞噬M.tb吞噬率的促进作用。(5)0,10,100,1000,10000ng/mL不同浓度LPS分别刺激PMA分化前后的THP-1细胞24h后,再与M.tb以1:50浓度比共孵育30min,流式细胞术检测LPS在THP-1细胞吞噬M.tb功能中的促进作用。(6)分别以抗人TLR4抗体HTA125阻断TLR4,以DPI(diphenyleneiodoniumchloride)阻断NOX2NADPH氧化酶后,再以LPS(1000ng/mL)作用THP-1(A)细胞24h,1:50浓度比例加入M.tb作用30min,流式细胞术分析TLR4及NOX2NADPH氧化酶信号途径在LPS促进THP-1(A)细胞吞噬M.tb中的作用。(7)不同浓度荧光素二醋酸酯(FDA(0.1-1.0μg/mL)),在磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.2)中标记M.tb。取佛波醇酯(PMA)诱导分化的THP-1(A)细胞与FDA标记M.tb于37℃孵育30min,洗涤细胞,加入小牛血清,置37℃孵育0~60min后,三蒸水裂解细胞,流式细胞术检测裂解细胞释放的M.tb荧光强度变化,分析计算THP-1(A)细胞对吞噬M.tb的杀伤功能。同时观察刺激剂LPS及阻断剂HTA125和DPI对杀伤功能的影响。(8)流式细胞术检测LPS(100ng/mL)对M.tb感染前后THP-1(A)细胞表面TLR4表达水平、胞内ROS产量的促进作用;Westernblot检测THP-1(A)细胞NOX2蛋白表达水平;荧光定量PCR检测THP-1(A)细胞胞内TLR4mRNA,NOX2mRNA基因表达水平。结果:(1)100μg/mL的FITC浓度标记M.tb的标记率可达(99.02±0.74)%,用于后续实验需要。(2)PMA诱导分化的THP-1(A)细胞在4h对M.tb-FITC的吞噬率未加台盼蓝淬灭组为(78.82±3.21)%与加台盼蓝淬灭组(68.88±0.46)%相比,差异具有统计学意义(P<0.05)。至6h时吞噬率(93.65±1.47)%达饱和。(3)THP-1(A)与M.tb比例从1∶1增加至1∶100,其吞噬率从(2.17±0.15)%增加至(35.62±2.49)%。100ng/mL的LPS在THP-1(A):M.tb-FITC达1:50时,吞噬率达(65.94±2.25)%,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)10ng/mL浓度的LPS即可促进巨噬细胞对M.tb的吞噬率,且随浓度增加吞噬率逐渐增高,10000ng/mL的LPS浓度其吞噬率达(94.07±3.55)%较对照组(23.41±3.22)%增加,差异有统计学意义(P<0.05)。(5)10μMDPI处理的巨噬细胞对M.tb的吞噬率降低至(75.93±1.06)%,20μM时降低更显著,吞噬率达(58.16±0.98)%(P<0.05)。HTA125预处理的巨噬细胞吞噬M.tb吞噬百分率(38.57±1.35)%和LPS刺激组(83.25±2.53)%相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。(6)1.0μg/mLFDA对M.tb的标记率可达(98.21±0.92)%,可满足杀伤实验的需要。THP-1(A)细胞对M.tb0~60min杀伤率随时间增加而增加,60min的杀伤率可达(54.16±2.17)%,与0min杀伤率(15.21±0.63)%相比较,差异具有显著性。(7)100ng/mLLPS对THP-1(A)细胞30min杀伤M.tb的MFI值可达365.23±1.58与对照组608.35±2.16比较,差异有显著性(P<0.01)。且随浓度增加杀伤能力增强,10000ng/mL的MFI值降低至216.59±4.21。(8)HTA125及DPI预处理的THP-1(A)细胞对M.tb-FDA的杀伤能力降低至385.92±25.98和302.35±25.47,较LPS刺激组268.54±32.73,差异有统计学意义(P<0.01)。(9)LPS可增强被M.tb抑制的巨噬细胞表面TLR4受体的表达率。(10)Westernblot结果显示LPS有助于上调被M.tb抑制的THP-1(A)巨噬细胞NOX2蛋白的表达量。(11)LPS可增强被M.tb抑制的THP-1(A)细胞ROS的产量。(12)荧光定量PCR检测基因表达量结果显示,经LPS刺激后,被M.tb抑制的THP-1(A)胞内的TLR4mRNA,NOX2mRNA基因表达量均明显升高。结论:LPS能通过上调TLR4及NOX2的表达水平和功能,促进巨噬细胞对M.tb的吞噬和氧依赖性杀伤。