卤代扁桃酸盐及其衍生物是化学工业中的重要支架,由于其良好的渗透性和稳定性,被广泛应用于有机合成,尤其是医药中间体的工业生产中。近年来,对映体纯的L-邻氯苯甘氨酸作为氯吡格雷的关键合成块,已经引起了广泛的关注与研究。D-扁桃酸脱氢酶和扁桃酸消旋酶在L-邻氯苯甘氨酸的生物合成中起关键作用,但是现有的D-扁桃酸脱氢酶和扁桃酸消旋酶对D-邻氯扁桃酸的催化活性相对较低,这在很大程度上制约了L-邻氯苯甘氨酸生物合成的发展。因此,为了消除邻氯扁桃酸盐的邻位氯取代对酶活性的抑制作用,提高邻氯扁桃酸盐的生物催化性能,我们借助于蛋白质工程技术,对D-扁桃酸脱氢酶进行工程改造以增强对卤代底物的催化性能。本研究的主要内容和结果如下:（1）以从短乳杆菌（Lactobacillus brevis）中挖掘出的新型D-扁桃酸脱氢酶Lb DMDH为研究对象,为了提高其对卤化底物的催化活性,通过定向进化成功获得了对D-邻氯扁桃酸具有更高催化活性的D-扁桃酸脱氢酶突变体Lb DMDHN253S,其催化活性约为Lb DMDH的29倍。此外Lb DMDHN253S的最适温度为50℃,更接近大肠杆菌的最适生长温度,表明它在以活细胞为催化剂的全细胞催化中可能更有利。同时Lb DMDHN253S对D-邻氯扁桃酸的Kcat值为2.08 s-1,显著高于Lb DMDH的Kcat值(0.09 s-1),表明Lb DMDHN253S对D-邻氯扁桃酸具有更高的催化效率。（2）以短乳杆菌（Lactobacillus brevis）来源的D-扁桃酸脱氢酶Lb DMDH为探针,采用基因组挖矿技术从哈尔滨乳杆菌（Lactobacillus harbinensis）中获得了一个新型的D-扁桃酸脱氢酶Lh DMDH,其对D-扁桃酸的活性高达1200U/mg,在已报道的D-扁桃酸脱氢酶中处于领先地位。相对于短乳杆菌来源的Lb DMDH来说,哈尔滨乳杆菌来源的Lh DMDH对D-扁桃酸和D-邻氯扁桃酸的催化活性更高,分别是Lb DMDH的4倍和2倍。因此本研究对D-扁桃酸脱氢酶Lh DMDH进行半理性设计辅助的定向进化,首先通过随机突变构建了两个活性略有提高的突变酶Lh DMDHD52G和Lh DMDHA59V。此外,我们已经确定Lb DMDHN253S突变体在我们之前的研究中对D-邻氯扁桃酸具有显著活性,并且Lb DMDH的第253个天冬酰胺对应于Lh DMDH的第252个天冬酰胺。因此,选择Lh DMDH的第52、59和252位点作为进一步研究的重点位点,以p ET28a-Lh DMDH为模板,利用全质粒PCR法将单点突变引入Lh DMDH基因序列中,从而构建单点突变菌株。根据筛选结果,选取酶活提高幅度较大的一些突变体,利用全质粒PCR法构建组合突变体,以期达到叠加突变优势的目的。经过三轮实验室进化,最终成功获得一个高催化活性的D-扁桃酸脱氢酶突变体Lh DMDHA59G/N252G,其活性约为Lh DMDH的6倍,大约是Lb DMDHN253S的10倍。与野生型相比,Lh DMDHA59G/N252G表现出优异的p H特性、表达水平、比活性和动力学参数。本研究以绿色发展理念为指导思想,以突破制约氯吡格雷中间体生产效率的关键技术瓶颈为目标。本研究的顺利实施,有望揭示D-氯代扁桃酸氯的取代位置影响D-扁桃酸脱氢酶活性的分子机制,拓宽D-扁桃酸脱氢酶的应用范围,为其它酶底物选择性的改造提供新思路,对丰富和完善酶工程基础理论及方法具有重要学术意义。