基于PI3K/AKT信号通路探讨泽漆汤对肺腺癌的干预机制

来源 :山东中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:reg8c4user
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目的:针对肿瘤的靶点基因和中药复杂的干预特点,在生物信息学和网络药理学技术指导下构建与之相适应的的研究模式,形成符合中医药优势特点及体现天然药物抗肿瘤的优势和价值取向的研究方法和策略,可进一步实现中医药抗肿瘤具体靶点预测和机制解析。本研究通过体外细胞实验分析了泽漆汤对肺癌A549细胞增殖、凋亡、侵袭、周期的影响,并以PI3K/AKT信号通路为切入点,对泽漆汤干预肺腺癌(LUAD)的作用机制进行了相关探讨,为LUAD的临床治疗提供了有效的中医药干预证据。方法:1.网络药理学指导下“药-靶”网络的构建 基于TCMSP提供的ADME参数(吸收,分布,代谢,排泄),以设定口服生物利用度(OB)>30%、药物相似性(DL)>0.18、Caco-2渗透性(Caco-2)>-0.14的标准对泽漆汤进行了活性成分的预筛选。然后通过TCMSP、Pub Chem和Swiss Target Prediction数据库预测这些成分化合物的作用靶基因。为了进一步分析靶基因之间的相互作用关系,基于STRING数据库和Cytoscape软件,实现了泽漆汤相关靶基因之间的蛋白相互作用(PPI)网络的构建和可视化。另外,为了更好地了解靶基因的相关功能和富集情况,我们使用DAVID数据库对预测的泽漆汤靶基因进行了GO和KEGG富集分析,以深入了解海量基因数据背后所表现的生物学意义。2.生物信息学指导下LUAD“靶点-通路”数据库的构建 基于TCGA数据库,获得LUAD相关的原始转录组数据和临床数据,并通过perl语言和Ensembl在线数据库实现对原始数据初步的整理及对基因的标准化注释。随后,通过R语言及edge R包进行LUAD相关基因的差异分析,并设定p<0.05和|log FC|>2为LUAD差异表达基因的筛选标准,然后基于数据库对差异表达基因进行PPI的构建及GO和KEGG功能富集分析。结合LUAD临床数据,对关键通路相关富集基因进行预后及突变相关分析,进一步挖掘关键通路及通路富集基因的功能。3.泽漆汤通过PI3K/AKT信号通路干预LUAD A549细胞系的实验研究 CCK-8法观察中药复方泽漆汤对LUAD A549细胞系细胞活性的影响。细胞划痕实验及Transwell实验用来观察不同浓度的复方药物对细胞迁移及细胞侵袭能力的影响。流式细胞仪分析进一步检测中药复方泽漆汤对A549细胞周期和凋亡的影响。最后Western Blot及qRT-PCR实验检测了细胞中PI3K、AKT、p-AKT、Cyclin D1蛋白表达及PI3K、AKT的m RNA表达水平。4.分子对接技术进行泽漆汤主要成分的干预探究 Chem Draw Ultra 12.0软件构建成分小分子的结构,并在Sybyl X中优化;RCSB数据库中提取对接基因的蛋白晶体结构并以“PDB Format”格式保存备用。然后使用Surflex-Dock程序对成分和蛋白分子进行分子对接并获得Surflex-Dock得分(总得分)评估分子对接结果,最后使用Py MOL软件进一步优化,对氢键及其结合部位进行观察、分析。结果:1.根据TCMSP最终共获得了泽漆中的13个成分,石见穿中的2个成分,生姜中的5个成分,人参中的18个成分,黄芩中的34个成分,桂枝中的4个成分,半夏中的10个成分,白前中的2个成分和甘草中的87个成分,去掉重复成分后共获得了泽漆汤相关的156个有效成分。在删除重复项后,从Swiss Target Prediction数据库和TCMSP数据库中共预测了与泽漆汤成分作用相关的530个靶基因。以p<0.05为筛选截止值的功能富集分析发现,泽漆汤的预测靶基因主要富集的KEGG通路涉及达178条,以Count数排序的前3条通路包括癌症通路、PI3K/AKT信号通路和化学致癌-受体激活通路。2.TCGA数据库中获得的LUAD相关转录组数据共包括594个样本,其中癌症样本535个,正常组织样本59个。经Ensembl数据库的标准化注释及edge R包的差异分析后,以p<0.05和|log FC|>2为筛选截止条件,最后共获得1421个LUAD相关差异表达基因,包括1096个上调基因,和325个下调基因。以p<0.05为筛选截止值的功能富集分析发现,LUAD相关的差异表达基因主要富集的KEGG通路有14条,包括PI3K/AKT信号通路、细胞周期、ECM-受体相互作用等。对PI3K/AKT信号通路富集的28个基因进行的Kaplan-Meier生存分析发现9个基因(CCNE1、COL6A6、COL11A1、EFNA3、FGF19、IL7R、VEGFD、SPP1和VWF)与LUAD患者生存关系密切,p<0.05代表差异具有统计学意义。3 CCK-8实验结果表明泽漆汤对可以抑制A549细胞的增殖,且抑制作用呈现剂量和时间的依赖性(p<0.05)。细胞划痕实验发现泽漆汤能显著抑制A549细胞的迁移能力,且表现出浓度依赖性(p<0.05)。侵袭实验相关结果显示,泽漆汤能显著降低A549细胞穿过Matrigel胶的细胞数,且统计分析发现高浓度比低浓度泽漆汤的效果更加显著,表明泽漆汤干预后可导致A549细胞侵袭能力明显下降,且受泽漆汤药物浓度的影响,具有浓度依赖性(p<0.05)。流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡的结果显示泽漆汤可促进细胞凋亡,影响细胞周期,诱导A549细胞G0/G1期阻滞。Western Blot实验发现泽漆汤组与PI3K特异性抑制剂LY294002组(10nmol/L)一样,较对照组显著降低了A549肺癌细胞中PI3K、AKT、p-AKT和Cyclin D1的蛋白表达水平(p<0.05),而qRT-PCR检测发现泽漆汤干预24h后,细胞内PI3K、AKT的m RNA表达水平明显下降。4对接结果显示多个泽漆小分子与PI3Kα,PI3Kβ,PI3Kγ,PI3Kδ,AKT1,AKT2,AKT3具有良好的结合效果,并且在分子对接的模型中存在稳定的结合位点。其中成分7-Angelyl-9-echimidinylheliotridine与PI3Kα,PI3Kβ,PI3Kδ及相关因子AKT1,AKT2,AKT3均有较好的结合,可形成多个氢键。成分beta-sitosterol与PI3Kγ和PI3Kδ结合较好。而成分euphoscopin B与PI3Kα,成分euphoscopin D与PI3Kβ之间也存在较好的结合。结论:本研究在生物信息学,网络药理学技术支持下,基于生物分子大数据可视化了泽漆汤多成分、多靶点的复方特点及LUAD多基因、多途径参与的复杂机制。并通过实验分析发现中药复方泽漆汤可抑制肺癌A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡,诱导A549细胞G0/G1期阻滞,且作用机制可能与泽漆汤干预PI3K/AKT信号通路有关。
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