【摘 要】
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本文围绕鸭瘟病毒UL25与UL17蛋白相互作用的关键区域进行筛选,将UL25蛋白中的相互作用关键氨基酸进行突变构建病毒突变株,对其作为候选疫苗的潜力展开研究。本文主要研究内容和获得的结果如下:1.DPV pUL25与pUL17相互作用的鉴定本文构建了真核表达质粒pCAGGS-Flag-UL17、pCAGGS-HA-UL25。将以上重组质粒分别进行单独转染或共同转染至DF-1细胞中,收取12 h、2
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本文围绕鸭瘟病毒UL25与UL17蛋白相互作用的关键区域进行筛选,将UL25蛋白中的相互作用关键氨基酸进行突变构建病毒突变株,对其作为候选疫苗的潜力展开研究。本文主要研究内容和获得的结果如下:1.DPV pUL25与pUL17相互作用的鉴定本文构建了真核表达质粒pCAGGS-Flag-UL17、pCAGGS-HA-UL25。将以上重组质粒分别进行单独转染或共同转染至DF-1细胞中,收取12 h、24 h、48 h和72 h时间点。使用间接免疫荧光实验检测蛋白的定位情况,结果显示,单独转染时,UL17蛋白的定位呈动态变化,24 h时,UL17蛋白主要集中在细胞核,随着表达时间的增加,UL17蛋白在细胞核中含量减少,而细胞质中含量增多;UL25蛋白在细胞质、细胞核中均有表达,且主要表达在细胞质中,随着表达时间的增加,UL25蛋白在细胞中的定位情况无明显变化。当二者共同转染时,UL25与UL17蛋白有一定的共定位现象。UL25蛋白的定位情况与单独存在时的定位情况相似,仍主要在细胞质中,细胞核内有少量分布。UL17蛋白在与UL25蛋白共表达的情况下,其定位的动态变化与单独存在时相似,从最初的核质分布,变为主要定位于细胞核,最后又变为了核质分布。并进一步通过免疫共沉淀实验证明UL25蛋白与UL17蛋白具有相互作用。2.DPV pUL25与pUL17相互作用区域的鉴定为了鉴定UL25蛋白与UL17蛋白相互作用的区域,本文构建pCAGGS-HA-UL251-133aa、pCAGGS-HA-UL25134-598aa、pCAGGS-HA-UL251-224aa、pCAGGS-HA-UL2553-598aa真核表达质粒。使用间接免疫荧光实验检测蛋白的定位情况。结果显示,pUL251-133aa、pUL25134-598aa、pUL251-224aa以及pUL2553-598aa单独表达时,在细胞质、细胞核中均有表达,且主要定位于细胞质中。pUL251-133aa、pUL25134-598aa、pUL251-224aa以及pUL2553-598aa分别与pUL17共表达时,均与pUL17有共定位现象,主要共定位于细胞核中,少部分共定位于细胞质中。通过免疫共沉淀实验证明pUL251-224aa以及pUL2553-598aa与pUL17具有相互作用。3.DPV UL25M突变株疫苗潜力初评利用Red同源重组构建DPV UL25M感染性克隆,获得重组病毒DPV UL25M。将DPV UL25M重组病毒细胞毒液经尿囊腔接种于10日龄鸭胚中,120 h后,接种鸭胚死亡率为90%,表明DPV UL25M对鸭胚具有高致死性。从剖检变化观察到明显的全身皮肤出血,且肝脏病变严重,伴有黄色坏死病灶出现,这些病理变化与DPV CHv-BAC-G亲本株表现一致,表明DPV UL25M对鸭胚具有高致病性。利用荧光定量PCR方法检测DPV UL25M在鸭胚内的动态分布规律,结果显示,在尿囊液和羊水混合液和肝脏中,DPV UL25M的增殖表现与DPV CHv-BAC-G无显著差异;而在脑组织和躯干中,72 h前DPV UL25M和DPV CHv-BAC-G的增殖表现出较显著的差异性,而在72～120 h时间段内,两者无明显差异。说明DPV UL25M在鸭胚中的增殖情况与DPV CHv-BAC-G相似。表明对pUL25的131aa、133aa和134aa三个位点进行了突变的重组病毒DPV UL25M毒力并未减弱。并且在检测DPV UL25M突变株在雏鸭体内的生物学特性时,未检测到DPV UL25M突变株在雏鸭体内的增殖。以上结果表明,DPV UL25M突变株不能成鸭瘟疫苗的候选株。
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