真菌毒素一直是农作物污染的一个大问题,其中常见的有黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等,以前大量的研究都是关于黄曲霉毒素,但是在粮食污染方面,赭曲霉毒素的影响也是不容忽视的。赭曲霉毒素是由在各种粮食作物中生长的曲霉菌和青霉菌产生的,当动物摄入各种霉变的农作物时,毒素会进入动物体内,经由食物也可进入人体。在赭曲霉毒素家族中,赭曲霉毒素A（OTA）毒性最强,对各种生物的威胁很大,能导致严重的疾病。OTA的稳定性很强,是一种无色无味的晶状化合物,具有强烈肾脏毒性、肝脏毒性、致畸、致突变性、并且能够引起癌症,但是其损伤下拨的作用机制尚不清楚,OTA损伤细胞的毒性作用机理有待考究。为了明确OTA对肝细胞作用的具体机制,本研究提取来自C57BL/6小鼠身上的肝原代细胞作为研究对象,研究OTA能否引起小鼠肝原代细胞的损伤以及损伤的机制,包括可能发生的各种细胞死亡类型。第一部分的主要内容是探讨于OTA对小鼠肝原代细胞的生物学作用。我们选用的实验动物为出生后28天的雄性C57BL/6小鼠,用改良二部分离法活体分离出肝原代细胞。经检测OTA对该细胞的半数致死量(IC50)为21.5μmol/L。为了研究对象能够在研究过程中状态良好,选取OTA的实验剂量为0、1.25、2.5、5、10μmol/L毒素剂量进行实验。首先在提取分离的细胞贴壁后用以上毒素浓度处理细胞后在0-120h内观察细胞增殖活性,其次再用以上浓度毒素处理48h后检测凋亡、乳酸脱氢酶（LDH）泄漏情况。结果发现OTA可以抑制细胞增殖,使LDH泄漏率增加,用流式细胞术和激光共聚焦等方式可以清楚得看到毒素对小鼠肝细胞的作用,毒素处理的小鼠肝细胞有出现明显的早期凋亡和晚期凋亡现象,这些现象都表明毒素对小鼠肝原代细胞具有明显的损伤作用。第二部分的主要内容是探讨OTA对小鼠肝细胞的生物学作用以及引起这种作用的机制,还有就是OTA是用那种细胞死亡方式引起小鼠肝细胞死亡。用0、1.25、2.5、5、10μmol/L OTA毒素剂量处理小鼠肝原代细胞,为了探讨OTA对小鼠肝原代细胞内氧化应激功能的影响,我们采取了检测细胞内活性氧（ROS）水平的方法,结果发现经OTA处理的肝原代细胞内ROS水平明显提高;为了探讨OTA是否影响了小鼠肝原代细胞线粒体功能,我们采取检测细胞内ATP水平,结果发现ATP有明显下降;为了探讨小鼠肝原代细胞DNA损伤情况,选择检测细胞培养液中8-羟基脱氧鸟苷（8-OHd G）水平,结果发现经OTA处理的小鼠肝细胞内8-OHd G含量明显升高。以上的研究表明OTA可能通过破坏了细胞氧化应激平衡、损伤了细胞的DNA、影响线粒体功能造成了细胞死亡。另一方面在探究OTA导致肝细胞死亡是否还有其他的死亡方式,考虑可能有细胞凋亡、细胞坏死性凋亡、细胞焦亡。我们检测状态更加稳定的小鼠肝癌细胞系Hepa1-6,能有效地对比毒素引起的各种死亡方式的区别。用Werstern blot方式检测蛋白Caspase 3、Caspase 9、PARP的表达情况来判断细胞凋亡的情况;通过检测蛋白RIP1、RIP3、MLKL、p-MLKL、Caspase8的表达情况来判断是否发生了细胞坏死性凋亡;还有检测跟细胞焦亡相关的GSDMD、GSDME的表达情况。结果表明,OTA处理组的Caspase 3、Csapase 9、PARP蛋白表达水平有明显上调,OTA引起的细胞死亡方式有可能是细胞凋亡;OTA处理组的RIP1、RIP3、MLKL、p-MLKL、Caspase8也有明显上调,说明细胞坏死性凋亡也可能是OTA引起肝细胞死亡的一种方式;但是跟细胞焦亡相关的GSDMD、GSDME的表达水平并没有出现提高,说明细胞焦亡有可能不参与OTA引起的肝细胞损伤。