奶山羊产业是我国奶业的重要成员之一,羊奶深受消费者青睐,但其基础母羊数量与质量存在严重不足,直接影响到本产业发展。性别控制技术由于能有效控制新生动物的性别,已经在众多动物中广泛应用,然而目前在理论上证据匮乏,在奶山羊产业中应用较少,而且效果不好,需要深入研究,破解其中存在的科学问题,获得的结果将直接应用于奶山羊,推动奶山羊产业发展。课题组前期研究发现,奶山羊X精子和Y精子存在一个显著差异的水通道蛋白7（Aquaporin 7,AQP7）。本研究首先从奶山羊睾丸组织中克隆得到AQP7基因完整的CDS区全长,成功构建原核表达载体,表达并纯化重组蛋白,利用纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体并检测X、Y精子中AQP7蛋白的表达情况,为研究AQP7蛋白以及通过AQP7控制精子性别奠定基础。研究结果如下:1.克隆得到奶山羊AQP7基因1077 bp序列,测序得到该基因CDS区全长993 bp,共编码330个氨基酸。对该基因的CDS区进行生物信息学分析,由二级结构分析得到该蛋白C端二级结构丰富;TMHMM预测该蛋白有3段膜外区;最终结合开放阅读框（ORF）预测结果得到适合作为抗原片段的339bp基因序列,克隆得到该抗原片段的基因序列。同源性分析发现该段序列与兔的同源性低,可作为免疫肽段。并分析该肽段稀有密码子比例,选择了适合表达重组蛋白的BL21（DE3）感受态细胞。2.构建了p ET32a（+）-AQP7重组载体,双酶切鉴定得到5900 bp的载体序列条带和339 bp的抗原片段基因序列条带,诱导表达得到30 k D的AQP7重组蛋白,并筛选出该重组蛋白最适表达条件为0.5 mmol/L的IPTG诱导6 h,探索蛋白表达形式发现重组蛋白以包涵体的形式存在于沉淀中,利用8 M尿素破碎包涵体并变性蛋白,后用Ni-NTA Resin对重组蛋白进行亲和纯化,SDS-PAGE目的条带显示纯化效果良好,对纯化后的蛋白进行梯度透析复性,复性后用BCA法测定AQP7重组蛋白的质量浓度≥2.0mg/m L。3.制备了奶山羊AQP7多克隆抗体,I-ELISA法检测到1:128000的抗体效价。Western blot检测发现,抗体在稀释5000倍时对抗原蛋白仍有良好的特异性识别,该抗体可以识别奶山羊睾丸组织中的AQP7蛋白,且在X精子和Y精子蛋白中检测到AQP7蛋白的差异表达,Y精子中AQP7蛋白含量高;在奶山羊精子上进行免疫荧光发现,该抗体可以和精子结合,AQP7蛋白定位于精子顶体;随后制作奶山羊睾丸组织切片并免疫荧光染色,发现该蛋白在精子发生的各阶段表达量有动态变化,且在分化为长形精子后表达量最高。综上所述,本研究成功克隆出奶山羊AQP7基因,纯化得到AQP7重组蛋白,制备出奶山羊AQP7多克隆抗体,利用该抗体检测到AQP7基因在奶山羊X、Y精子上表达存在差异,为后续研究奶山羊AQP7基因提供理论基础与分子工具。