传染病是家禽的一类常见疾病,给养禽业造成重大经济损失。给家禽免疫疫苗,使其产生抗病原微生物的免疫反应是预防家禽传染病的一项重要措施。雏鸡出壳后体内含有较高水平的母源抗体,对雏鸡有免疫保护作用。但母源抗体也会干扰疫苗免疫作用,降低免疫效果[1]。为了避免母源抗体的干扰,早期疫苗免疫常在母源抗体下降到一定水平后进行。因此,在母源抗体下降至可为机体提供免疫保护的水平之后和在疫苗诱导的抗体产生之前存在一个时间空缺,我们称其为“危险窗口期”。处在“危险窗口期”的鸡,因其母源抗体和疫苗诱导的抗体水平均低于保护性水平,容易受到病原微生物的感染。于是,研究能够缩小“危险窗口期”的方法,减少动物发病,在养禽生产上具有实际意义。使疫苗诱导的抗体提前产生或提高抗体水平有助于缩小“危险窗口期”,减少鸡感染病原的机会。前期研究证明人参茎叶皂苷（GSLS）和硒（Se）（GSLS-Se）可增强动物的免疫功能,促进疫苗诱导抗体的产生。本文首先研究GSLS-Se对鸡弱毒疫苗的免疫增强作用,然后观察该组方在鸡早期免疫时缩小“危险窗口期”的作用。由于鸡弱毒疫苗免疫常经过点眼滴鼻途径,疫苗通过免疫器官哈德氏腺（HG）发挥作用,本文还研究GSLS-Se在鸡弱毒疫苗中对H G组织和细胞的作用,探讨该组方增强弱毒疫苗免疫的作用机理。1、含GSLS和Se鸡弱毒疫苗稀释剂的配方研究目的:研究含GSLS和Se（亚硒酸钠,以Se含量计算）的生理盐水溶液作为鸡弱毒疫苗稀释剂时对疫苗免疫的增强作用。方法:将GSLS和Se按不同比例混合,用生理盐水溶解配制成疫苗稀释剂（GSLS-Se）,用GSLS-Se稀释鸡新城疫和传染性支气管炎二联弱毒疫苗（NDV-IBV二联苗）后滴鼻点眼免疫12日龄肉鸡,免疫后10、12、14、18天采血分离血清,检测血清中鸡NDVHI效价和鸡IBV特异性抗体滴度。结果:GSLS溶液（5 μg/50 μL）和Se溶液（25μg/50μL）均能够显著提高鸡NDV HI效价和鸡IBV特异性抗体滴度,尤其是二者联用时（（5μg GSLS+25 μg Se）/50μL）抗体显著高于单独使用,故选择作为疫苗稀释剂配方进行后续研究。2、GSLS-Se对鸡弱毒苗免疫的影响目的:观察GSLS-Se对鸡弱毒疫苗的增强免疫作用。试验一 GSLS-Se在NDV-IBV二联苗免疫中缩小“危险窗口期”的作用。分别用GSLS-Se和生理盐水稀释鸡新支二联弱毒苗,以滴鼻点眼方式免疫12日龄肉鸡,非免疫组作为空白对照,在免疫后每三天采血检测鸡血清中NDVHI效价、IBV特异性抗体滴度,至免疫后27天。试验二GSLS-Se在IBDV弱毒苗免疫中缩小“危险窗口期”的作用。分别用GSLS-Se和生理盐水稀释鸡IBDV弱毒苗,以滴鼻点眼方式免疫12日龄肉鸡,非免疫组作为空白对照,每四天采血检测鸡血清中IBDV特异性抗体滴度,至免疫后36天。试验三GSLS-Se在NDV-IBV二联苗免疫中对体液和细胞免疫的影响。分别用GSLS-Se和生理盐水稀释鸡新支二联弱毒苗,滴鼻点眼免疫12日龄肉鸡,非免疫组作为空白对照,免疫后48h采血,检测血清中IFN-γ、IL-4含量;免疫后14天无菌采集抗凝血和非抗凝血,分离抗凝血中的外周血淋巴细胞用于淋巴细胞增殖试验,分离非抗凝血中的血清用于病毒中和抗体检测。试验四GSLS对鸡弱毒疫苗喷雾免疫的影响。分别用GSLS-Se和生理盐水稀释IBDV弱毒苗,使用喷雾方式免疫12日龄肉鸡,每组15只,非免疫组作为空白对照,于免疫后1-5周采血,检测血清中鸡IBDV特异性抗体滴度。试验五GSLS-Se在养殖场对鸡弱毒疫苗点眼滴鼻免疫的影响。按照鸡场免疫程序,于8日龄时用GSLS-Se和生理盐水稀释鸡新支二联弱毒苗,以滴鼻点眼方式免疫,每组免疫500只蛋鸡,于免疫后2、3周检测血清中NDV HI效价和鸡IBV特异性抗体滴度。试验六GSLS对养殖场鸡弱毒疫苗饮水免疫的影响。分别用GSLS-Se和生理盐水稀释IBDV弱毒苗,使用饮水方式免疫12日龄蛋鸡,每组5000只,按照鸡场免疫程序,于加强免疫后一周采血,检测血清中鸡IBDV特异性抗体滴度。结果:在缩短“危险窗口期”方面,GSLS-Se可缩短鸡对NDV、IBV和IBDV的“危险窗口期”,促进早期抗体的产生,并延长抗体持续时间;在对新支二联苗体液和细胞免疫方面,GSLS-Se可提高鸡外周血淋巴细胞刺激指数,鸡血清IFN-γ、IL-4含量,特异性中和抗体含量;在适用的免疫方法上,使用GSLS-Se在商业化养殖鸡场中进行滴鼻点眼和饮水免疫,可提高鸡血清中NDV、IBV和IBDV特异性抗体水平;但GSLS-Se对喷雾免疫无显著增强作用。说明GSLS-Se可缩短鸡“危险窗口期”,提高体液和细胞免疫,并适用于滴鼻点眼和饮水两种免疫方式。3、不同环境储存对GSLS-Se促进疫苗免疫效果的影响目的:观察GSLS-Se在不同环境下储存一定时间后是否还具有免疫促进作用。方法:将不同浓度（工作液浓度与20倍浓缩浓度）、储存方式（室温不避光,室温避光,4℃）、储存时间（3、6、9、12个月）的GSLS-Se作为疫苗稀释剂稀释鸡新支二联弱毒苗,以滴鼻点眼方式免疫鸡,免疫后1、2周采血分离血清,检测血清中检测NDVHI效价和IBV特异性抗体滴度,并将结果与新配置GSLS-Se稀释剂的抗体效价进行对比;根据药典方法测定溶液中的GSLS和Se含量。结果:工作液浓度和20倍浓缩浓度的GSLS-Se疫苗稀释剂均可在光照室温、避光室温、4℃等常规储存条件下储存3、6、9、12个月仍保持较好的佐剂作用,维持稳定的药物含量。4、GSLS-Se对鸡哈德氏腺组织的免疫调节作用研究目的:探究GSLS-Se在滴鼻点眼后对作为NDV感染的主要部位之一的哈德氏腺的免疫调节机理。方法:将GSLS-Se作为疫苗稀释剂稀释鸡NDV弱毒苗,以滴鼻点眼方式免疫12日龄肉母鸡,14天后采集哈德氏腺,使用ELISA检测组织上清液中sIgA含量,IHC检测组织切片中IgG+、IgA+、IgM+细胞指数;将GSLS-Se稀释剂对鸡滴鼻点眼给药,分别检测给药后24、48、72h时哈德氏腺中IFN-γ、IL-6和IgA的mRNA相对表达量,以探究合适的转录组测序采样时间;对该组样品和不给药对照组样品进行转录组测序并进行差异表达基因（DEGs）、Geneontology（GO）功能分析和Kyoyo Encyclopediaof Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析等生物信息学分析。结果:发现GSLS-Se可显著提高鸡哈德氏腺中sIgA含量和IgG+、IgA+、IgM+细胞指数;GSLS-Se给药后48 h后,哈德氏腺中IFN-γ、IL-6和IgA的mRNA相对表达量达到峰值;转录组测序结果表明,GSLS-Se组中的差异表达基因,免疫相关的GO条目和KEGG通路显著富集,TLR信号通路和MAPK信号通路可能是参与免疫调节的主要信号通路,GSLS-Se可能是通过哈德氏腺免疫细胞中的免疫相关基因谱发挥免疫调节作用,使免疫ND疫苗的鸡提前产生抗体并提高免疫应答水平。5、GSLS-Se对鸡哈德氏腺单细胞的作用研究目的:为探究GSLS-Se在体外培养的条件下对哈德氏腺单细胞的免疫调节作用。方法:将处死后的鸡哈德氏腺无菌取出,制成单细胞悬液,铺板后加入不同浓度的GSLS-Se/GSLS/Se,使用cck8法检测GSLS-Se作用后的细胞存活力;使用荧光酶标仪检测早期凋亡水平;使用JC-1检测线粒体膜电位比值;Flu-3/AM探针检测Ca2+通道浓度;使用ELISA测定细胞培养上清中细胞因子（IFN-γ和IL-4）含量;RT-qPCR检测细胞内细胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17）和IgA含量,并从细胞水平对哈德氏腺组织转录组结果再次进行验证。结果:在哈德氏腺体外培养的单细胞中,加入微量GSLS-Se（浓度范围在5 ng Se-l ng GSLS～1 ng Se-0.2 ng GSLS之间）,可提高细胞存活率,降低细胞早期凋亡水平,提高线粒体膜电位JC-1比值,降低钙离子通道浓度,提高细胞培养上清液中的细胞因子（IFN-γ、IL-4）水平和细胞内细胞因子（IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17）和IgA的mRNA相对表达量,并在体外验证与哈德氏腺组织转录组结果具有相同趋势。综上所述,采用含有5 μg GSLS+25 μg Se的生理盐水稀释鸡弱毒活疫苗可缩短鸡对NDV、IBV和IBDV“危险窗口期”,促进早期抗体产生并延长抗体持续时间;提高鸡体液和细胞免疫,提高NVD、IBV中和抗体含量、淋巴细胞增殖指数、血清IFN-γ和IL-4含量。在临床试验中证实该配方的稀释剂可使用滴鼻点眼和饮水两种方式进行免疫。该稀释剂在工作液浓度和20倍浓缩浓度下在光照室温、避光室温、4℃等常规储存条件下储存一年仍保持较好的佐剂作用,维持稳定的药物含量,可能是一种合适的值得推广的禽用疫苗稀释剂。在对哈德氏腺的免疫作用研究中发现,GSLS-Se可显著提高鸡哈德氏腺中sIgA含量,IgG+、IgA+、IgM+细胞指数,可能通过抗氧化和调节免疫相关酶的活性来发挥免疫调节作用,并显著富集哈德氏腺中TLR信号通路和MAPK信号通路等免疫相关信号通路。在哈德氏腺体外培养的单细胞中发现,加入微量GSLS-Se可提高细胞存活率,降低细胞早期凋亡水平,提高线粒体膜电位JC-1比值,降低钙离子通道浓度;提高细胞培养上清液中的细胞因子（IFN-γ,IL-4）水平和细胞内细胞因子（IFN-γ,IL-1β、IL-4、IL-6、IL-17）和IgA的mRNA相对表达量。