背景 根据分泌细胞因子的差异，CD4~+T细胞可分被为Th1和Th2两个亚群。正常情况下，Th1／Th2之间保持着稳定的平衡。许多疾病与Th1／Th2失衡密切相关。Th1／Th2的分化受到体内外许多因素的调节，外来抗原通过抗原递呈细胞(APC)有效地影响Th1／Th2分化。分枝杆菌感染所引起的机体免疫应答是以Th1样反应为主的免疫应答，BCG是迄今为止最安全、最稳定的疫苗。通过基因工程手段获得重组BCG，可以调节Th1／Th2平衡，有望成为相关疾病治疗的新途径。 目的 以屋尘螨抗原Der p2为目标，利用基因工程手段制备以胞壁嵌合形式表达的重组BCG，观察接种该重组BCG对BALB／c小鼠免疫应答的影响。 方法 采用基因分段合成连接方法，构建并改造完整的Der p2基 第四军医大学博士学位论文 中文摘要 因；通过载体 pPro EX Hb介导 Der pZ在大肠杆菌中初步表达；以巴斯 德毕赤酵母（Pichia PastoriS）作为真核表达系统，利用整合型表达质 粒pPICgK，将Der pZ基因整合入毕赤酵母的染色体中，G418压力筛 选高效表达重组体，用ELISA法测定其抗原性；利用PCR从结核分枝 杆菌毒株H37Rv的基因组中扩增并克隆19kDa抗原胞壁区及其上游调 控元件门《S）基因，克隆入 ECOliECG穿梭载体 pOLYG，构建能携 带外源蛋白并在分枝杆菌宿主胞壁上表达的载体 pCW；将 Der pZ基因 克隆入pCW，以牡牛分枝杆菌（Mvaccae）作为宿主，利用分子生物 学和免疫学方法，鉴定 pCW介导的 Der pZ表达；用电转导法制备 Der pZ个CWrBCG，以生理盐水为对照，分别将 Der pZTCWrBCG和 BCG 腹腔注射接种于6～8周龄和新生BALB／c ’J’鼠，用ELISA法测定小鼠 血清、脾细胞培养上清（SCCS）中IL－4、IFN－Y水平，用双色荧光标 记一流式细胞仪法测定脾脏细胞Th亚群，评价rBCG对小鼠免疫应答的 影响。 结果 DNA序列测定证实，所构建的 Der pZ基因与所设计的核着 酸序列完全一致，实现了为适合分枝杆菌表达所进行的改造。基因改造 并未改变Der pZ的氨基酸序列，并在大肠杆菌宿主获得理想表达，表 达量约占总蛋白量的 20％。利用 pPICgK，成功将 Der pZ基因整合入毕 赤酵母的染色体中，在 G4压力筛选下，获得了高水平的表达，诱导 72 h，蛋白表达至高峰，约占总蛋白的 47％（约 200 mg·L”’人该产物 能与用天然抗原制备的多克隆抗体结合。成功扩增并克隆 19七s基因， 构建成能在分枝杆菌胞壁上表达 Der pZ的穿梭载体 pCW。分子生物学 和免疫学方法证实，pCW能够介导潮霉素抗性，并携带外源基因进入 分枝杆菌，调控外源基因正确表达和定位。接种后，与生理盐水相比较 发现：rBCG和 BCG成年和新生小鼠血清和 SCCS中 IL－4水平显著降 6 第四军医大学博士学位论文 中文摘要水平显著降低（各组p均功．001卜IFN－Y水平显著升高（成年鼠：rBCG和 BCG组分别为 p功．05和p吻．001；新生鼠：rBCG和 BCG组均为p刃．001）；同样地，与对照组相比，rBCG和BCG免疫的小鼠脾脏细胞经体外刺激后产生的 IFN－Y水平明显升高O均＜0．00卜 而 IL＊水平则明显降低平均＜0．001入另一方面，无论成年鼠还是新生鼠，在CD4”的脾脏细胞中，IFN－Y“的细胞比例明显升高平均＜0．ofX而 IL－4”细胞比例明显降低平均功．01），提示：出＊G和＊＊G均可诱导h优势免疫应答。此外，在两个年龄组小鼠，接种rBCG者脾细胞均产生了较BCG组更高水平的IFN－Y 平均＜0．05人 同时，用rBCG免疫的两组小鼠脾脏 CD4可FN－p“的细胞比例也明显高于 BCG免疫各组中均功．05），提示：rBCG诱导了 Der pZ特异性 hl优势应答。 结论①经改造的 Der pZ基因可由原核和真核宿主正确表达；②构建的PCW载体能携带外源基因进入分枝杆菌，并调控其在分枝杆菌胞壁上正确表达和定位；③无论rBCG还是BCG通过腹腔注射免疫，均可诱导不同年龄BALB几小鼠产生hl免疫应答；④表达在rBCG细胞壁上的Der pZ被当成BCG的成份，并为机体的免疫系统所识别，进一步刺激了 Der pZ特异性的 hi应答。这些结果表明，胞壁型抗原重组BCG可作为有效的疫苗，特异性地调节Thlffllt平衡。