【摘 要】
：
猪表皮生长因子(porcineEpidermalGrowthFactor，pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽类生长因子，具有刺激细胞分裂、增殖与分化，促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性。有
论文部分内容阅读
猪表皮生长因子(porcineEpidermalGrowthFactor，pEGF)是一种含有53个氨基酸的单链多肽类生长因子，具有刺激细胞分裂、增殖与分化，促进离子交换和细胞外基质合成等生物学特性。有文献报道pEGF对提高母猪繁殖率及对抗断奶应激具有显著作用。因此，本研究用毕赤酵母来表达重组pEGF，为其临床应用打下基础。
为了获得可以用于生产的pEGF活性蛋白，首先构建了重组的分泌表达载体pPIC9-pEGF。先根据pEGF的氨基酸序列，利用毕赤酵母对密码子偏好性合成了pEGF基因，以该基因为模板，设计一对引物，使PCR产物的5端含有XhoⅠ限制性内切酶位点，3端含有编码6个组氨酸标签以及EcoRⅠ位点。然后将PCR产物克隆到分泌表达载体pPIC9构建了pPIC9-pEGF。将构建好的质粒pPIC9-pEGF用BglⅡ线性化，然后用电击转化法转化毕赤酵母获得转化子，用MD平板和MM平板筛选出Mut+和Muts型转化子。挑取确定表型的转化子在含YPD培养基的96孔板中培养后，取50μL菌液于PCR管中，用酵母裂解酶lyticase破坏菌壁，释放出基因组DNA，用斑点杂交法(dot-blotting)筛选多拷贝整合转化子。结果不同的转化子的杂交信号强弱不等，说明中其中所含的pEGF基因的多少也不一致，信号越强的转化子中pEGF的基因拷贝数就越多。对多拷贝转化子在30℃条件下进行小量诱导表达，表达上清进行Tricine-SDS-PAGE电泳。结果在Tricine-SDS-PAGE电泳图中，每个工程菌在6KD至14.4KD之间位置都有一个蛋白条带，而且斑点杂交杂交信号最强的工程菌，表达量最高。
利用融合蛋白中的组氨酸标签，建立了His-tag亲和层析方法来获得目的蛋白。纯化的结果表明分泌的表达上清经过Ni-NTA组氨酸结合树脂的纯化，可以获得纯度较高的目的蛋白。将该纯化蛋白用抗His-tag的抗体进行蛋白质印迹(westernblotting)分析，结果在分子量11KD以下的位置出现印迹条带。将His-tag亲和层析方法纯化后产物的冻干粉分别送往上海有机化学研究所和上海基康公司进行分子量的测定和蛋白质N端测序。分子量的测定结果表明送检样品中含有多个物质，但含量最高的物质的分子量为7169D，与Glu-Ala-pEGF-6His融合蛋白理论的分子量7170.96D相差1.96D。N端测序的结果：送检样品中含有2条肽，一条肽的序列为NSYSECPP(S)HDGYCL，与pEGF的N端的序列相同；另一条肽为EANSYSEC(P)PSHDGY，这是由于pEGF的N端的信号肽中的Glu-A1a(EA)切除不完全所致。以上结果表明，本研究得到的酵母表达产物主要是EA-pEGF-6His以及pEGF-6His融合蛋白。
该融合蛋白的成功表达和鉴定为pEGF活性研究和临床应用打下了基础。
其他文献
摘要：学生在高考作文中暴露的这些问题也反映了我们在平时作文教学中存在着这样或那样的不足，我们只有正确面对并在今后的工作中不断改进，这样才能使作文教学获得长足的发展。 关键词：高中语文 作文教学 应注意 进入高中，学习作文应该注意些什么呢？首先该明白，写好作文跟哪些因素相关。如果作静态的分析，作文包括观点、材料和语言表达这"三要素"。新的课程标准规定高中的学生要多角度去观察生活，力求表达对自然、
摘要：所谓“想象”，是指在原有感性形象的基础上，创造出新形象的心理过程。正是有了想象，人类才能够超越常规思维的约束，冲破现有知识经验的局限，以大胆、奇特的方式对所要解决的问题进行创造性的探索，找出解决问题的途径。所以说，想像构成了创新的基础，是一种极其可贵的思维品质。 关键词：高中语文 想象力 教学策略 语文是一门想象时空极大的学科，在教学中更应抓住各种契机，采取各种手段，着力培养学生的想象力
摘要：2012年7月中下旬，我有幸参加了香洲区教育局与美国亨廷顿大学（Huntington University）为香洲区小学英语青年教师举办的高水准、快节奏、重实效的联合培训项目。通过此次培训，我提升了教学理论水平与教学技能、提高了课堂实践的驾驭能力、结识了诸多优秀的外籍教师和同行。此次集中培训恰逢期末考试结束，我与参加该项目的其他老师一样，对此次能近距离、全方位地与优秀外籍教师同堂演练、观摩切
在钟山煤矿的长期生产实践中,我们发现了一系列的顺层滑动断裂。其规模虽不很大,但对煤矿生产的影响并不很小,故在此对这种断裂的特征、产生的影响作一粗浅探讨,以便在今后
暑假到了，爸爸媽妈带小花去海洋馆玩。海洋馆里的鱼色彩斑斓，非常漂亮。小花拍了很多美丽的照片。回来后，爸爸帮小花把照片P了一下。P完的照片和原图有5个不一样的地方。宝宝，你能找出来吗？仔细观察，然后用笔圈出不同的地方吧。 加点料 1.海洋馆有很多美丽的深海鱼，妈妈可以给宝宝普及海洋知识。 2.妈妈扫描二维码，和宝宝一起欣赏儿歌《海底世界》。
摘要：新课标下的课程改革几年来一直是人们关注的一个热点。做为教育者要改变过去的观念，与时俱进，才能跟上时代的步伐。在初中数学教学上要变传授知识为让学生主动学习知识，充分发挥学生主体性和教师的主导作用。 关键词：新课改 教师 初中数学 一、重新认识，转变观念 当今世界经济是知识经济，经济发展、国力增强等不在依赖于自然资源或物资力量等物质资料，具有高度科学文化素养和人文素养的劳动者，对于21世纪
摘要：高中数学教师在教学的过程中，要拓宽对数学的认识，让学生懂得数学的价值；要巧妙利用教材加强高中生数学意识和能力的培养；可以实施“问题解决”形式的教学，通过数学建模的活动和教学，进一步培养学生的数学应用意识和能力。在高中数学教学中，既要培养学生解决实际问题的能力，还要加强学生数学应用意识和能力的培养。这就要求教师要教会学生提出问题、分析问题以及解决带有实际意义的数学问题，形成应用数学的意识和能力
叶圣陶老先生曾经说过：“教是为了不教”就是说，教给学生的最重要的不是知识，而是获取知识的方法，古人云：“授人以鱼，不如授人以渔”说得也是这个道理。 新课程改革的教学理念强调：基础教育的任务不仅仅是传授知识，更重要的是让学生改变单一的接受性学习，掌握科学的学习方法，通过研究性学习，参与性学习，体验性学习和实践性学习，培养终身学习的愿望和能力，促使学生知识技能、情感态度与价值观的整体发展。新课程把“
摘要：新课标要求英语课堂教学不仅要有预设，而且要有生成。科学预设与动态生成是相辅相成的，二者缺一不可。有了预设，并在预设中有所生成，说明师生之间有了较好的互动；在此生成的基础上，如果又有许多非预设的生成，说明学生的学习积极性得到了充分发挥。这时教师一定要因势利导，随时捕捉学生的疑问、想法、创见等精彩瞬间，高屋建瓴，选择恰当的问题作动态生成的“课眼”；改变原来的教学程序或内容，自然地让课堂教学在健康
摘要：学校是培养人才的摇篮，是传承文化的阵地。武术作为中华民族优秀传统体育项目，受到了必要的重视而进入了高校体育课堂，受到了学生的欢迎，在弘扬中国传统文化、丰富高校学生课余生活、提高学生身体素质、培养民族精神等方面做出了不可磨灭的贡献。然而，当前我国高校武术教学却陷入一种低迷的发展状态，曾一度受宠的国粹受到了冷落，而舶来的跆拳道、空手道却成为大学生追逐的一种时尚。针对这种不正常的现象，笔者收集了大