研究背景:　　 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以慢性进行性关节破坏为主的自身免疫性疾病，可累及全身多个关节尤其是双手、腕、肘、肩、膝、踝和足关节，临床表现包括关节疼痛、肿胀、功能下降，最终可造成关节破坏、畸形和功能丧失。目前RA无根治的方法，其中非甾类抗炎药、糖皮质激素主要是控制症状；改善病情药可延缓关节破坏，控制病情，但起效慢，毒副作用大；生物制剂价格昂贵，且有潜在的感染、脱髓鞘病变、致肿瘤危险，且仅对部分难治性RA有效。因此，开发新的更安全、有效的药物仍是目前RA研究的主要方向。　　 RA的基本病理特征为滑膜炎及血管翳形成，滑膜炎主要表现为滑膜细胞数量异常增多，衬里层由原来的1～3层增生到5～6层甚至更多，其中的成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)是介导RA滑膜炎症反应和关节破坏的主要效应细胞。活化的FLS可分泌多种炎症介质、促炎性细胞因子、趋化因子、粘附分子和生长因子，促进炎症反应的发生和持续，促进新生血管及血管翳的形成，还可产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)等多种细胞外基质降解酶，引起关节软骨、软骨下骨和关节周围的软组织破坏。　　 RA-FLS在慢性炎症过程中被激活后，出现细胞表型的显著改变，具有不完全转化细胞的特性，即使脱离炎症环境仍持续活化，增殖能力升高，逃脱接触抑制，呈现肿瘤样增殖，并具有侵袭能力。研究表明RA-FLS在炎症滑膜中过度增殖的机制包括：①增殖活跃：RA患者关节液中存在的多种自分泌因子以及体外培养的RA-FLS合成并释放的炎症细胞因子、生长因子可导致RA-FLS增殖和活化；②凋亡减少：RA-FLS中存在凋亡相关基因的异常表达，如Bcl-2、Fas、P53等，体外培养的RA-FLS中Fas mRNA表达较高，提示其可能处于一种激活状态；RA-FLS中Bcl-2 mRNA过量表达，可能抑制Fas介导的细胞凋亡；另外，RA-FLS表达阻断凋亡的多种因子，如IL-15、FLIP、centrin等；③前体细胞的补充：循环中的间质前体细胞具有多向分化能力，可被功能性地募集到滑膜层，向FLS分化和成熟；④细胞衰老的减缓：RA病人的滑膜细胞中能够检测到明显的端粒酶活性，提示细胞衰老的延缓和减少可能是促进RA-FLS增殖的机制之一。因此抑制RA-FLS的增殖、诱导其凋亡可能成为治疗RA的重要靶向。　　 海藻多糖由海藻经过提纯纯化等工艺获取，是一类多组分混合物，由不同的单糖基通过糖苷键相连而成，包含海藻细胞间和细胞内的各种高分子碳水化合物，呈水溶性。海藻多糖具有多种药理作用，包括抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗血管生成及增强免疫力等，其毒副作用极小。海藻多糖抗肿瘤的作用是通过多种途径实现的：①增强机体的免疫功能，激活T细胞、B细胞、NK细胞，间接抑制和杀伤肿瘤细胞；②影响肿瘤细胞细胞周期，进而影响其分裂、增殖、生长；③抗血管效应：抑制血管生成，影响肿瘤细胞生长；④诱导抑癌基因p53的表达增加，诱导肿瘤细胞的分化与凋亡；⑤促进bax基因的表达，抑制bcl-2基因的表达，诱导肿瘤细胞凋亡；⑥影响凋亡信号通路中的IGF-IR、PI3K/Akt、ERK等信号分子诱导肿瘤细胞凋亡。　　 国内有研究者在临床应用以羊栖菜入药的古方加减海藻玉壶丸治疗RA，结果发现治疗60d后，总有效率为96％。另有研究显示口服含有褐藻纲、绿藻纲和(或)红藻纲的提取物可预防和改善关节炎。因此，进一步研究海藻多糖治疗RA的机制可为开辟RA治疗新药提供理论依据。　　 目前国内外尚无海藻多糖对RA-FLS凋亡影响的相关研究和报道。本研究通过盲式细针滑膜活检术获取RA滑膜组织，体外分离、培养、纯化FLS，体外采用海藻多糖干预RA-FLS，探讨海藻多糖对RA-FLS凋亡的影响及机制。　　 第一章、类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞的原代培养　　 目的:　　 以改良组织块法分离、培养、纯化活检滑膜组织FLS，了解RA-FLS的生长特性，为进一步的生物学实验做准备。　　 材料和方法：　　 临床确诊的RA活动期患者，行膝关节盲式细针滑膜活检术获取滑膜组织，采用改良组织块培养法进行RA-FLS的原代培养，并通过光镜、透射电镜、流式细胞术、免疫细胞化学染色等方法进行鉴定，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)比色法检测RA-FLS的细胞增殖，绘制细胞生长曲线。　　 统计学处理：所有数据处理均采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。正态分布资料以均数±标准差((x)±s)表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)或Kruskal-Wallis检验，多组间均数的两两比较采用Bonferroni法。显著性水准为0.05。　　 结果：　　 1.RA-FLS的原代培养采用改良组织块法1～2 d后见长梭型FLS从组织块边缘游走生长，并逐渐增多呈放射状，一周后细胞迅速生长，约2～3 w长满瓶底的70％～80％。　　 2.RA-FLS计数及活性鉴定对RA-FLS第3～5代细胞行台盼蓝染色、计数，RA-FLS长满25 cm2培养瓶时细胞总数为(8.30±1.65)×105/瓶，活细胞百分率均＞95％。　　 3.RA-FLS的鉴定倒置相差显微镜下观察可见RA-FLS呈长梭形，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁清晰，细胞周围可见分泌物聚集。透射电镜下观察可见FLS核染色质较疏松，呈细颗粒状分布在核周围，核仁明显，粗面内质网丰富，胞浆突起长而粗，胞浆中往往缺乏高尔基复合体，可见少量小泡和囊泡。波形蛋白(Vimentin)、细胞角蛋白(cytokeratin，CK)、CD68免疫细胞化学染色结果显示第3～5代RA-FLS Vimentin、CK染色阳性，胞浆内见大量棕黄色颗粒，CD68染色阴性。流式细胞术检测3～5代RA-FLS CD55+细胞百分率为(95.34±2.47)％。　　 4.CCK-8比色法显示RA-FLS倍增时间约7 d。　　 小结：　　 采用改良组织块法进行RA-FLS体外培养成功率高，细胞游出时间较早，细胞生长速度较快，到达传代时间较短。当传代至第3～5代时，RA-FLS的纯度高，增殖活性高，生长状态好，可用于进一步的生物学实验。　　 第二章、海藻多糖对类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞凋亡的影响及机制　　 目的：　　 了解海藻多糖能否抑制体外培养的RA-FLS增殖并诱导其凋亡，并初步探讨凋亡诱导效应的机制。　　 材料和方法：　　 1.CCK-8比色法检测不同浓度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预不同时间(0、1、2、3、4、5 d)后对RA-FLS增殖的影响。　　 2.Hochest33258染色法检测不同浓度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预不同时间(0、3、4、5 d)后对RA-FLS凋亡的影响。　　 3.TUNEL染色法检测不同浓度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预不同时间(0、3、4、5 d)后对RA-FLS凋亡的影响并计算凋亡率。　　 4.Western Blot检测不同浓度(0、15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预于4d后对RA-FLS caspase-3、bax、bcl-2蛋白表达的影响。　　 5.统计学处理　　 所有数据处理均采用SPSS13.0统计软件包进行统计学处理。正态分布资料以均数±标准差((x)±s)表示；多组间均数的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)或Kruskal-Wallis检验，多组间均数的两两比较采用Bonferroni法。显著性水准为0.05。　　 结果：　　 1.CCK-8比色法结果显示海藻多糖可呈剂量和时间依赖性抑制RA-FLS的增殖。不同浓度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预RA-FLS4 d后，细胞增殖抑制率分别为12.72％、24.22％、35.40％(F=689.278，p＜0.001)；20 mg/ml的海藻多糖干预RA-FLS不同时间(3、4、5 d)后，细胞增殖抑制率分别为10.92％、24.22％、37.00％(F=96.114，p＜0.001)。　　 2.Hochest33258染色法结果显示不同浓度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预不同时间(3、4、5 d)后均可诱导RA-FLS凋亡。　　 3.TUNEL染色法结果显示海藻多糖可呈剂量和时间依赖性促进RA-FLS的凋亡。　　 4.Western Blot结果显示海藻多糖可呈剂量依赖性影响RA-FLS caspase-3、bax、bcl-2蛋白的表达。不同浓度(15、20、25 mg/ml)的海藻多糖干预于4 d后可引起RA-FLS caspase-3蛋白表达增高、bax蛋白表达增高、bcl-2蛋白表达降低(F=101.986、44.674、67.295，p＜0.001、0.001、0.001)。　　 小结　　 海藻多糖在体外能抑制RA-FLS增殖，诱导其凋亡，且增殖抑制作用及凋亡诱导作用呈剂量和时间依赖性，其凋亡机制是通过上调细胞内bax蛋白及下调bcl-2蛋白表达影响线粒体通路，从而促进caspase-3活化裂解，导致RA-FLS凋亡。